蛍光内視鏡をめざした高分子型分子プローブの創製

文献情報

• 文献番号: 201313031A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 蛍光内視鏡をめざした高分子型分子プローブの創製
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H23-３次がん-一般-001
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 前田 浩(崇城大学 ＤＤＳ研究所)

研究分担者(所属機関)

• 方　軍(崇城大学　薬学部　/　ＤＤＳ研究所 )
• 中村　秀明(崇城大学　薬学部　/　ＤＤＳ研究所 )

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 7,308,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

癌の診断と治療は何れも化学物質を用いる点においては共通であり、両者とも薬剤の癌局所への集積に基づいている。本課題は両者の同時達成を目指す。即ち高分子型蛍光[FL]分子プローブおよび光増感剤[PS]を癌局所に選択的にデリバリーすることを目的とするが、それは本申請者が発見したEPR効果(enhanced permeability and retention effect)の原理に基づいている。一方、内視鏡光源は連続波長で充分な光量があるので、各々の蛍光分子プローブ（以下、蛍光ナノプローブ）の分光特性に適合する光学フィルターシステムの組み合わせにより表層癌が肉眼の10～100倍の高感度で検出可能となることを我々は予備的に認めている。癌部に選択的にこれら蛍光ナノプローブ（PSを含む）を集積できることをPSに応用した例はない。この研究の目的はEPR効果に基づく腫瘍デリバリーによりPSの腫瘍選択的な集積を可能にする。EPR効果は肝転移娘結節で調べるとφ 0.3mmの微小癌に対しても超高感度の検出が可能になる。即ち、安全なPDTを可能にする。
従来のPDTに使用するPSは全身くまなく分布し、日常的な光さえも正常の皮膚などに傷害を起こすため、あまり普及しなかったが、本課題が成功すれば、蛍光ナノプローブによる癌のPDTは飛躍的に向上するといえる。このような画期的な診断と治療をめざし、EPR依存的DDSの知識を持つのは当研究室のみである。事実、我々は亜鉛プロトポルフィリンミセルは蛍光と同時に一重項酸素を生じ、治療効果があることをマウス腫瘍において予備的に確認している。

研究方法

(1) 平成24年度の実験、民間企業との連携・協力の継続
(2)マウス癌の他に、DMBAやアゾキシメタンによるラットの発ガンの乳癌および大腸癌の自家発癌モデルを作製する。予算措置が十分であれば、ヒト食道癌のSCIDマウスモデルを用いる。
(3) 蛍光内視鏡による微小癌結節の検出
内視鏡メーカーと協力し、蛍光内視鏡の試作タイプを作製する。アゾキシメタン誘発大腸癌モデルラットに対し高分子型分子プローブを投与し、蛍光内視鏡により腫瘍の微小癌結節が検出可能か否かを検討する。検出された腫瘍結節に対しては、組織切片を病理学的に検定する。

結果と考察

本成果in vivoの自然自家発癌モデル（乳癌、大腸癌）でも、蛍光ナノ粒子の腫瘍選択的な集積をみとめ直接的な蛍光の画像化に成功した。さらにZnPPという多機能性蛍光プローブを結合した蛍光ナノプローブは3～30%(w/w)のローディングで、光照射をXenon光源、内視鏡光源またはブルー蛍光灯を用いても効率よく、一重項酸素を発生し、抗腫瘍効果をみた。このナノプローブの1回のiv投与で、光を内視鏡光源の40～60％の出力で1～4回照射することにより固型癌を完治するものもみられた。実用的には100-200WのXenon光源を用いて1/10000の光量で殺細胞効果があることから、レーザーよりも波長特性の優れたXenonあるいはブルー蛍光灯による表層癌、さらに内視鏡照射による体腔内、胸腔、腹腔、胸膜、大網、肺・肝の表層、子宮、膀胱、食道以下の消化管、尿道にも容易に応用が見込まれる。

結論

本蛍光ナノプローブは合成が簡単なため、製造コストは抗体医薬の1/100以下で供給可能と思われる。またこの手法はピラルビシンなどのcytotoxic agentとの結合物でもin vivoの治療の有効性が全く毒性のない状況で著効になることを確認している。今後のサポートが望まれる。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201313031B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 蛍光内視鏡をめざした高分子型分子プローブの創製
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H23-３次がん-一般-001
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 前田 浩(崇城大学 ＤＤＳ研究所)

研究分担者(所属機関)

• 方　軍(崇城大学　薬学部 / ＤＤＳ研究所)
• 中村　秀明(崇城大学　薬学部 / ＤＤＳ研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

癌の診断と治療は何れも化学物質を用いる点では共通であり、両者とも薬剤の癌局所への集積に基づいている。即ち高分子型蛍光[FL]分子プローブおよび光増感剤[PS]を癌局所に選択的にデリバリーすることを目的とするが、それは本申請者が発見したEPR (enhanced permeability and retention) 効果の原理に基づいている。一方、内視鏡光源は連続波長で強力な光量があるので、各々の蛍光分子プローブ（以下、蛍光ナノプローブ）の分光特性に適合する光学フィルターの組み合わせにより表層癌が肉眼の10～100倍の高感度で検出可能となることを我々は予備的に認めている。癌部に選択的にこれら蛍光ナノプローブ（PSを含む）を集積できることをPSに応用した例はない。この研究目的はEPR効果に基づく腫瘍デリバリーによりPSの腫瘍選択的な集積をめざす。
従来のPDTに使用するPSは全身くまなく分布し、日常的な光さえも正常の皮膚などに傷害を起こすためあまり普及しなかった。本課題が成功すれば、蛍光ナノプローブによる癌のPDTは飛躍的に向上するといえる。このような画期的な診断と治療をめざしたEPR依存的DDSの知識を持つのは当研究室のみである。

研究方法

・癌選択的蛍光/光増感（FL/PS）高分子型分子プローブ(蛍光ナノプローブ)の合成
・高分子型分子プローブの一重項酸素生成能
・担癌マウスおよびラットを用いたin vivo イメージング
・PS光照射による細胞毒性作用の研究
・担癌マウスに対するPS光照射療法
・マウス癌の他に、DMBAなど化学発癌剤による自家発癌の乳癌および大腸癌のモデルを作製
・蛍光内視鏡による微小癌結節の検出

結果と考察

高分子化した蛍光プローブ(ローダミン、ZnPP、ICGなど)、さらにアルブミンやトランスフェリンなどの血清タンパクの蛍光標識プローブは、はっきりと選択的に腫瘍部に集積し、蛍光により腫瘍が検出できることがわかった。HPMA高分子化したZnPPも静注後、420nmで励起、550nmの蛍光でS-180腫瘍をin vivoイメージング装置（IVIS）でみると腫瘍によく集積し、腫瘍部の蛍光画像をきれいに描出した。
本実験に用いる大腸癌モデルは、IRCマウスにデキストラン硫酸（経口投与）とアゾキシメタンの腹腔内投与を行うことで作成している。今後大腸癌の早期検出と予防、さらに治療をめざした研究を進展させる。
ニトログリセンの併用によりローダミン標識アルブミンの血中濃度が高く維持され、腫瘍においてより均一な蛍光染色を認めた。HPMA-ZnPP投与後、キセノン光（400-700nm）をDMBA誘発ラット乳癌に対して試みたところ、HPMA-ZnPP投与量と光量の両doseに比例して副作用なしで制癌効果を示した。
高分子制癌剤ポリマー結合型ピラルビシン（P-THP）は腫瘍部選択的に集積していることが蛍光像で判定できた。投与後6時間目から腫瘍部の蛍光が認められ、経時的に漸増する。
プロトタイプ蛍光内鏡の作成：在来型の直進方向を観察・光照射する内視鏡に加え、管壁、腹壁などは90度側面を観察・光照射するタイプも作成した。
HPMA-ZnPPのPDT抗腫瘍効果：濃度依存性と光照射依存性。S-180腫瘍モデルにおいて、HPMA-ZnPPをiv注射後、光照射を行った。市販のブルー蛍光灯を用いても治療効果が得られた。これらの結果よりHPMA-ZnPPは腫瘍の検出およびPDT治療剤としてより優れていることがわかった。

結論

1.ポリマー結合型PSはEPR効果により腫瘍選択的集積性を示す極めて優れたナノPS（NPS）である。
2.上の事実に基づき、固型腫瘍を蛍光像として超早期に検出が可能になる。
3.そのようなNPS投与マウスおよびラット自家乳癌腫瘍に対し、照射を行ったところ、確実に抗腫瘍効果を示した。
4.ポリマー結合型蛍光プローブはそのままPBS中では光をあててもROSは生じないが、ZnPPを遊離させるか（腫瘍の低pH）、細胞膜成分レシチンの接触により遊離のZnPPとなり、光応答性的にROSを生じることがわかった。市販の低分子PSのレザフィリンでは、そのままで光によりROSを生じるため光毒性が強烈であった。
5.上のNPSを用いるのと同様にアントラサイクリン系のDDS製剤 [P-THP] 投与担癌マウスにおいて、薬剤は癌部のみに集積することを可視化画像でみることができた。これは担当医師が自分の投与した薬剤が癌に集まったかどうかを確認するとともに、投与患者にそのことをインフォームすることができ、安心感を与えることができる。
6.ZnPP含有NPS製剤は多面的な抗癌作用があり、多くの他の制癌剤と比べはるかに優れていることを確信した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201313031C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: これまでのＰＤＴ療法のドグマの2点を改革した。; （1） ナノサイズ光増感剤の著明な圧倒的な優位性（EPRによる腫瘍選択的集積）; （2） He/Neレーザーによらない内視鏡光源（xenon）、およびブルー蛍光灯での有用性
• 臨床的観点からの成果: ・P-THPを用いた高度進行前立腺がんで肺と骨と転移のある症例に対して著明な臨床効果; （Targeted Oncology, 2015年発表）。; ・EPR効果の原発性癌と転移癌に対する有効性の証明（Proof of Concept）
• ガイドライン等の開発: 特になし
• その他行政的観点からの成果: 固型癌の超早期検出と人にやさしい治療法のプロトタイプ確立に目途がついた。; その一部は、; ・Targeted Oncology (2015) 臨床論文; ・Future Science Open (2015); ・Adv. Drug Deliv. Review (2015)などに発表; ・Controlled Release Society学会で報告
• その他のインパクト: 【受賞】; 西日本文化賞、日本DDS学会永井賞、日本癌学会吉田富三賞、熊日賞、; トムソン・ロイター引用栄誉賞（化学部門）; 米国ミシガン州Wayne State University 2017 Roland T. Lakey 賞。; ; 【新聞】; ・熊本日日新聞 H24/6/2、6/15、H27/3/11 ; 【講演】; ・EPRシンポジウムin NCI/NIH, 基調講演 ; ・国際学会：微小循環学会, シンポジスト; ・日本分子イメージング学会ワークショップ

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 43件
• その他論文(和文): 5件
• その他論文(英文等): 4件
• 学会発表(国内学会): 18件
• 学会発表(国際学会等): 37件
• その他成果(特許の出願): 2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: スチレン-マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）の誘導体
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2013-239222 ; 発明者名: 前田浩、方軍、中村秀明 ; 権利者名: 前田浩 ; 出願年月日: 20131119

• 特許の名称: 高分子型蛍光分子プローブ
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 5904602 ; 発明者名: 前田浩、橋爪誠、方軍 ; 権利者名: 前田浩 ; 出願年月日: 20120905 ; 取得年月日: 20160325 ; 国内外の別: 国内は成立済

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: H. Maeda; Vascular permeability in cancer and infection as related to macromolecular drug delivery, with emphasis on the EPR effect for tumor-selective drug targeting; Proc. Jpn. Academy, Series B. , 88 , 53-71 (2012)
• 原著論文2: H. Nakamura, L. Liao, Y. Hitaka他; Micelles of zinc protoporphyrin conjugated to N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) copolymer for imaging and light-induced antitumor effects in vivo; J. Control. Release , 165 , 191-198 (2013)
• 原著論文3: H. Nakamura, T. Etrych, P. Chytil他; Two step mechanisms of tumor selective delivery of N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer conjugated with pirarubicin via an acid-cleavable linkage; J. Control. Release , 174 , 81-87 (2014)
• 原著論文4: J. Fang, L. Liao, H. Yin他; Enhanced bacterial tumor delivery by modulating the EPR effect, and therapeutic potential of Lactobacillus casei; J. Pharm. Sci. , 103 , 3235-3243 (2014)
• 原著論文5: H. Maeda; Emergence of EPR effect theory and development of clinical applications for cancer therapy; Therapeutic Delivery (Future Science) , 5 , 627-630 (2014)
• 原著論文6: K. Tsukigawa, H. Nakamura, J. Fang他; Effect of different chemical bonds in pegylation of zinc protoporphyrin that affects drug release, intracellular uptake, and therapeutic effect in the tumor; Eur. J. Pharm. Biopharm , 89 , 259-270 (2015)
• 原著論文7: H. Nakamura, J. Fang and H. Maeda; Development of next-generation macromolecular drugs based on the EPR effect: challenges and pitfalls; Expert Opinion on Drug Delivery , 12 , 53-64 (2015)
• 原著論文8: H. Nakamura, E. Koziolova, T. Etrych他; Comparison between linear and star-like HPMA conjugated pirarubicin (THP) in pharmacokinetics and antitumor activity in tumor bearing mice; Eur. J. Pharm. Biopharm. , 90 , 90-96 (2015)
• 原著論文9: J. Fang, L. Liao, H. Yin他; Photodynamic therapy based on tumor-targeted polymer-conjugated zinc protoporphyrin and irradiation with xenon light; Future Science OA , FSO4 (2015); http://www.future-science.com/doi/pdf/10.4155/fso.15.2
• 原著論文10: K. Tsukigawa, L. Liao, H. Nakamura他; Synthesis and therapeutic effect of styrene-maleic acid copolymer conjugated pirarubicin; Cancer Sci. , 106 , 270-278 (2015)
• 原著論文11: H. Maeda; Toward a full understanding of the EPR effect in primary and metastatic tumors as well as issues related to its heterogeneity; Adv. Drug Deliv. Rev. , 91 , 3-6 (2015)
• 原著論文12: H. Maeda, J. Fang, H. Nakamura; Great expectation for innovative PDT and tumor imaging using fluorescing nanophotosensitizers that utilizes EPR effect; JSMI Report(日本分子イメージング学会誌) , 9 , 3-10 (2015)
• 原著論文13: H. Dozono, S. Yanazume, H. Nakamura他; HPMA copolymer-conjugated pirarubicin in multimodal treatment of a patient with stage IV prostate cancer and extensive lung and bone metastases; Targeted Oncology , 11 , 101-106 (2016)
• 原著論文14: H. Maeda. K. Tsukigawa, J. Fang; A retrospective 30 years after discovery of the EPR effect of solid tumors: treatment, imaging, and next-generation PDT-problems, solutions, prospects; Microcirculation , 23 , 173-182 (2016)
• 原著論文15: J. Fang, K. Tsukigawa, L. Liao他; Styrene-maleic acid-copolymer conjugated zinc protoporphyrin as a candidate drug for tumor-targeted therapy and imaging; J. Drug Targeting , 24 , 399-407 (2016)
• 原著論文16: H. Nakamura, E. Koziolovác, P. Chytilc他; Pronounced cellular uptake of pirarubicin versus that of other anthracyclines: Comparison of HPMA copolymer conjugates of pirarubicin and doxorubicin.; Mol. Pharm. , 13 , 4106-4115 (2016)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-02
• 更新日: 2018-06-15

収支報告書

• 文献番号: 201313031Z
• 報告年月日: 2014年10月01日

収入

• (1)補助金交付額: 9,500,000円
• (2)補助金確定額: 9,500,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	2,639,511円
		人件費・謝金	3,159,900円
		旅費	1,247,055円
		その他	261,534円
	間接経費		2,192,000円
合計			9,500,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-10
• 更新日: -