文献情報
文献番号
201427031A
報告書区分
総括
研究課題名
血液・尿中バイオマーカーの非臨床・臨床適用に関する評価要件の確立研究
課題番号
H24-医薬-指定-028
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
斎藤 嘉朗(国立医薬品食品衛生研究所 医薬安全科学部)
研究分担者(所属機関)
- 熊谷 雄治(北里大学医学部附属臨床研究センター)
- 前川 京子(国立医薬品食品衛生研究所 医薬安全科学部 )
- 鈴木 孝昌(国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子医薬部 )
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
22,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
バイオマーカーの医薬品開発における利用を促進するための評価要件案作成の一環として、血液・尿中バイオマーカーに関し、特に問題となる測定用試料の採取要件、および非臨床動物で見出されたバイオマーカーのヒトへの外挿に関する評価要件案の作成を最終目標として、最終年度である平成26年度は日本人試料を用いた各種試料要件に関する検討、ヒト薬物性肝障害試料・情報の収集、および評価要件案の作成を行った。
研究方法
1）メタボローム解析
イオン性代謝物測定は、抽出後、液体クロマトグラフ-リニアイオントラップ型質量分析計及びガスクロマトグラフ-四重極リニアイオントラップ型質量分析計にて行った。疎水性代謝物測定は、抽出後、下層（有機層）及び上層（水層）を分取し、下層は、超高性能液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計を用いて、リン脂質等一般脂質代謝物を網羅的に測定した。一方、酸化脂肪酸を含む上層は、さらに固相抽出を行い、超高速液体クロマトグラフ－三連四重極リニアイオントラップ型質量分析計を用いての多重反応モニタリング法にて測定した。
2) プロテオーム解析
尿から抽出した蛋白質をトリプシン消化し、精製後、液体クロマトグラフー四重極/FT型タンデム質量分析計での解析に供した。MS/MS測定から得られたフラグメントイオンパターンより、データベースを検索して蛋白質の同定を行った。
イオン性代謝物測定は、抽出後、液体クロマトグラフ-リニアイオントラップ型質量分析計及びガスクロマトグラフ-四重極リニアイオントラップ型質量分析計にて行った。疎水性代謝物測定は、抽出後、下層（有機層）及び上層（水層）を分取し、下層は、超高性能液体クロマトグラフ－飛行時間型質量分析計を用いて、リン脂質等一般脂質代謝物を網羅的に測定した。一方、酸化脂肪酸を含む上層は、さらに固相抽出を行い、超高速液体クロマトグラフ－三連四重極リニアイオントラップ型質量分析計を用いての多重反応モニタリング法にて測定した。
2) プロテオーム解析
尿から抽出した蛋白質をトリプシン消化し、精製後、液体クロマトグラフー四重極/FT型タンデム質量分析計での解析に供した。MS/MS測定から得られたフラグメントイオンパターンより、データベースを検索して蛋白質の同定を行った。
結果と考察
1) 内在性代謝物に関する解析
日本人試料では、約500種のイオン性内在性代謝物(アミノ酸、等)を定量し、31%が若年層(25-35歳)において、25%が老年層(55-65歳)において性差を示し、23%が男性において、24%が女性において年齢差を示した。また、日本人、白人、及び黒人における人種差では、約50%以上の代謝物が、日本人と白人・黒人間で差異が認められた。また脂質代謝物に関しては、血漿で128種のグリセロリン脂質・スフィンゴ脂質を測定した。有意に異なるレベルを示した代謝物の割合は、総同定代謝物数の16％（男女差）、31％（年齢差）、及び47%（人種差）であった。イオン性代謝物と同様に、白人と黒人間では差異を示す代謝物の割合は小さいものであった。さらに、日本人における薬物性肝障害患者を用いた解析で、有意差が認められた62種中8種は、性、年齢、人種の影響を受けにくいものであった。
2) 内在性蛋白質に関する解析
尿を対象に日本人由来試料の解析を行い、白人と同様に個人差が大きいことを確認するとともに、個人差の原因となっていた蛋白質を同定した。肥満度は影響を及ぼさなかった。また、性差、年齢差を示す蛋白質を網羅的に同定した。これらの蛋白質はバイオマーカーとしては不適と考えられる。さらに、薬物性肝障害発症に関連する尿蛋白を複数の同定した。
日本人試料では、約500種のイオン性内在性代謝物(アミノ酸、等)を定量し、31%が若年層(25-35歳)において、25%が老年層(55-65歳)において性差を示し、23%が男性において、24%が女性において年齢差を示した。また、日本人、白人、及び黒人における人種差では、約50%以上の代謝物が、日本人と白人・黒人間で差異が認められた。また脂質代謝物に関しては、血漿で128種のグリセロリン脂質・スフィンゴ脂質を測定した。有意に異なるレベルを示した代謝物の割合は、総同定代謝物数の16％（男女差）、31％（年齢差）、及び47%（人種差）であった。イオン性代謝物と同様に、白人と黒人間では差異を示す代謝物の割合は小さいものであった。さらに、日本人における薬物性肝障害患者を用いた解析で、有意差が認められた62種中8種は、性、年齢、人種の影響を受けにくいものであった。
2) 内在性蛋白質に関する解析
尿を対象に日本人由来試料の解析を行い、白人と同様に個人差が大きいことを確認するとともに、個人差の原因となっていた蛋白質を同定した。肥満度は影響を及ぼさなかった。また、性差、年齢差を示す蛋白質を網羅的に同定した。これらの蛋白質はバイオマーカーとしては不適と考えられる。さらに、薬物性肝障害発症に関連する尿蛋白を複数の同定した。
結論
評価要件として、内在性代謝物に関しては、血液を対象に検討を行い、下記の結果を得た。
1) ラット：イオン性及び脂質代謝物のいずれでも、食餌の有無による影響が最も大きく、次いで性差と週齢差がレベル差をもたらす要因であった。一方、採血時間（午前、午後）と絶食時間による差は、相対的に小さいものであった。またラットとヒトの代謝物の性差・年齢差に関する外挿性は低く、それぞれの探索時に別々に考慮する必要性が示唆された。
2) ヒト：白人を対象にした詳細解析では、血漿と血清差が最も大きな要因となり、次いで性差と年齢差も認められた。凍結融解は脂質代謝物で大きく、一部で2倍程度の差が認められた。イオン性代謝物では凍結融解の影響が少ない血清が、脂質代謝物では凝固反応で酸化脂肪酸やリゾリン脂質の変化が大きいことから血漿が、それぞれマトリックスとして有用と考えられた。イオン性代謝物では、白人に比して日本人で性差は相対的に大きいが、脂質代謝物では逆の傾向を示した。またイオン性と脂質代謝物のいずれでも、日本人と白人または黒人間でメタボロームプロファイルが大きく異なることが示され、日本人の基礎データの蓄積が重要と考えられた。また、性差・年齢差を示す代謝物は、日本人と白人で一致する分子種も認められたが、一部、日本人特有の分子種も認められた。
蛋白質に関しては、尿を対象に検討を行い、下記の結果を得た。
1) ラット：性差が最も大きく影響し、雄または雌特異的に発現している蛋白質を同定した。週齢差については、高週齢の雄ラットの一部において高発現量の蛋白質が個体差の要因となることを明らかにした。絶食に関しては大きな影響は認められなかった。
2) ヒト：白人、日本人を対象に検討を行った。最も大きな要因としては個体差が挙げられ、その原因となる蛋白質を同定した。一部は、白人と日本人間で共通であった。また白人では、肥満度が個体差の要因となり得ることを明らかにした。さらに性差、年齢差をもたらす蛋白質を同定した。
1) ラット：イオン性及び脂質代謝物のいずれでも、食餌の有無による影響が最も大きく、次いで性差と週齢差がレベル差をもたらす要因であった。一方、採血時間（午前、午後）と絶食時間による差は、相対的に小さいものであった。またラットとヒトの代謝物の性差・年齢差に関する外挿性は低く、それぞれの探索時に別々に考慮する必要性が示唆された。
2) ヒト：白人を対象にした詳細解析では、血漿と血清差が最も大きな要因となり、次いで性差と年齢差も認められた。凍結融解は脂質代謝物で大きく、一部で2倍程度の差が認められた。イオン性代謝物では凍結融解の影響が少ない血清が、脂質代謝物では凝固反応で酸化脂肪酸やリゾリン脂質の変化が大きいことから血漿が、それぞれマトリックスとして有用と考えられた。イオン性代謝物では、白人に比して日本人で性差は相対的に大きいが、脂質代謝物では逆の傾向を示した。またイオン性と脂質代謝物のいずれでも、日本人と白人または黒人間でメタボロームプロファイルが大きく異なることが示され、日本人の基礎データの蓄積が重要と考えられた。また、性差・年齢差を示す代謝物は、日本人と白人で一致する分子種も認められたが、一部、日本人特有の分子種も認められた。
蛋白質に関しては、尿を対象に検討を行い、下記の結果を得た。
1) ラット：性差が最も大きく影響し、雄または雌特異的に発現している蛋白質を同定した。週齢差については、高週齢の雄ラットの一部において高発現量の蛋白質が個体差の要因となることを明らかにした。絶食に関しては大きな影響は認められなかった。
2) ヒト：白人、日本人を対象に検討を行った。最も大きな要因としては個体差が挙げられ、その原因となる蛋白質を同定した。一部は、白人と日本人間で共通であった。また白人では、肥満度が個体差の要因となり得ることを明らかにした。さらに性差、年齢差をもたらす蛋白質を同定した。
公開日・更新日
公開日
2015-05-26
更新日
-