文献情報
文献番号
201419090A
報告書区分
総括
研究課題名
神経再生性人工細胞外マトリクスを用いた神経疾患治療法の検討
課題番号
H24-神経・筋-若手-004
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
柿木 佐知朗(独立行政法人国立循環器病研究センター 生体工学部)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 障害者対策総合研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
3,308,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
高齢化社会の急速な進展により、パーキンソン病などの内因性神経疾患や糖尿病・脳卒中による神経変性疾患などの外因性神経疾患は増加傾向にある。これらに対する治療法として、神経幹細胞の移植や末梢神経の再生などの組織再生医工学的なアプローチが注目されている。これらを達成するためには、内・外因性神経疾患における神経再生に特化した細胞外環境を構築できる、生体安全性に優れた人工マテリアルの開発が求められる。
これまでに我々は、神経再生医療への応用を志向した神経再生性人工細胞外マトリクス（人工タンパク質）の生合成を試みてきた。この人工細胞外マトリクスは、エラスチン骨格の繰り返し配列（（VPGIG）n）（Yamaoka T. et al., Biomacromolecules 4(2003)1680） とラミニン-Ｉ由来配列（AG73）（Nomizu M. et al., J. Biol. Chem. 273(1998)32491）を組み合わせた単純な構造であり、エラスチン配列に特徴的な温度応答性とAG73の優れた神経再生促進性を兼備している。本研究は、この人工細胞外マトリクスの内・外因性神経疾患治療への応用の可能性を模索することを目的として、平成２４年度に開始した。
既有の人工タンパク質（Histag-RKRLQVQLSIRT-GRL-(VPGIG)30-VPLE；VP-AG）が、in vivoにおいて想定していたほどの神経再生性を示さなかったことから、前年度より新たにエラスチン骨格にラミニン由来IKVAV配列を組み込んだ人工タンパク質のベクター作製に着手した。本年度は、その発現用ベクターを用いた大量発現系を構築し、ポリ乳酸/人工タンパク質混合配向ファイバーの作製とその機能評価を目的とする。
これまでに我々は、神経再生医療への応用を志向した神経再生性人工細胞外マトリクス（人工タンパク質）の生合成を試みてきた。この人工細胞外マトリクスは、エラスチン骨格の繰り返し配列（（VPGIG）n）（Yamaoka T. et al., Biomacromolecules 4(2003)1680） とラミニン-Ｉ由来配列（AG73）（Nomizu M. et al., J. Biol. Chem. 273(1998)32491）を組み合わせた単純な構造であり、エラスチン配列に特徴的な温度応答性とAG73の優れた神経再生促進性を兼備している。本研究は、この人工細胞外マトリクスの内・外因性神経疾患治療への応用の可能性を模索することを目的として、平成２４年度に開始した。
既有の人工タンパク質（Histag-RKRLQVQLSIRT-GRL-(VPGIG)30-VPLE；VP-AG）が、in vivoにおいて想定していたほどの神経再生性を示さなかったことから、前年度より新たにエラスチン骨格にラミニン由来IKVAV配列を組み込んだ人工タンパク質のベクター作製に着手した。本年度は、その発現用ベクターを用いた大量発現系を構築し、ポリ乳酸/人工タンパク質混合配向ファイバーの作製とその機能評価を目的とする。
研究方法
新規人工細胞外マトリクス(IKVAV-(VPGIG)60) (IK-VP)の発現用大腸菌株を作製し、Overnight ExpressTM Autoinduction Systemを用いて30℃でIK-VPを発現誘導した。His-tagアフィニティーカラムと透析で精製した。
ポリL-乳酸（Mw=106000）とIK-VPを質量比１：１で、最終濃度がそれぞれ１０％となるように1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解し、円板型ターゲットを用いたエレクトロスピニング法で、ファイバーの配向が揃う条件を検討した。ポリL-乳酸/IK-VP混合配向ファイバーをリン酸緩衝溶液中に浸漬し、２４時間後に走査型電子顕微鏡でファイバーの安定性を観察した。さらに、ポリL-乳酸/IK-VP混合配向ファイバー上にDRGニューロンを播種し、Neurofilamentを免疫染色して突起の伸長を評価した。
ポリL-乳酸（Mw=106000）とIK-VPを質量比１：１で、最終濃度がそれぞれ１０％となるように1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解し、円板型ターゲットを用いたエレクトロスピニング法で、ファイバーの配向が揃う条件を検討した。ポリL-乳酸/IK-VP混合配向ファイバーをリン酸緩衝溶液中に浸漬し、２４時間後に走査型電子顕微鏡でファイバーの安定性を観察した。さらに、ポリL-乳酸/IK-VP混合配向ファイバー上にDRGニューロンを播種し、Neurofilamentを免疫染色して突起の伸長を評価した。
結果と考察
IK-VPのアミノ酸配列をコードした発現用ベクターの作製と、それによって形質転換された大腸菌株（RosettaTM(DE3)ｐLysS）を得た。さらに、その大量発現系と精製条件を最適化し、約１２０ｍｇ/１L培養の高純度IK-VPを生合成することができた。
得られた高純度IK-VPとポリL-乳酸の混合溶液を1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノールで調製し、様々な条件（ターゲット回転数、電位差、ニードル-ターゲット間距離、溶液濃度など）でエレクトロスピニングしてファイバーの配向化を検討した。その結果、ターゲット回転速度１３００rpm、印加電圧±６．０ｋV、ニードル-ターゲット間距離１５ｃｍの条件で配向の揃ったファイバーを作製できた。IK-VPとポリL-乳酸との混合マイクロファイバーを３７℃のPBSに２４時間浸漬させて、その安定性を評価したところ、形状は変化せず安定に保持されていた。
IK-VPとポリL-乳酸との混合配向性マイクロファイバー上でラットDRGニューロンを７２時間培養したところ、接着数が増加し、ニューロフィラメント陽性の長い軸索がファイバーの配向に沿って伸長している様子が見られた。
得られた高純度IK-VPとポリL-乳酸の混合溶液を1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノールで調製し、様々な条件（ターゲット回転数、電位差、ニードル-ターゲット間距離、溶液濃度など）でエレクトロスピニングしてファイバーの配向化を検討した。その結果、ターゲット回転速度１３００rpm、印加電圧±６．０ｋV、ニードル-ターゲット間距離１５ｃｍの条件で配向の揃ったファイバーを作製できた。IK-VPとポリL-乳酸との混合マイクロファイバーを３７℃のPBSに２４時間浸漬させて、その安定性を評価したところ、形状は変化せず安定に保持されていた。
IK-VPとポリL-乳酸との混合配向性マイクロファイバー上でラットDRGニューロンを７２時間培養したところ、接着数が増加し、ニューロフィラメント陽性の長い軸索がファイバーの配向に沿って伸長している様子が見られた。
結論
本年度は、昨年度に得たエラスチン様繰り返し骨格配列（(VPGIG)60；VP）へのラミニン由来神経再生性IKVAV配列の導入とその大量発現系の確立、さらにそれら人工タンパク質とポリL-乳酸の配向型混合マイクロファイバーの作製とラットDRGニューロンの接着および軸索伸長性をin vitroで評価した。
IK-VPの大量発現系を確立でき、その高い突起伸長活性が認められたことから、IK-VPが神経再生に特化した人工細胞外マトリクスとして、細胞移植補助材や末梢神経再生チューブ基材などに利用できる可能性が示唆された。
IK-VPの大量発現系を確立でき、その高い突起伸長活性が認められたことから、IK-VPが神経再生に特化した人工細胞外マトリクスとして、細胞移植補助材や末梢神経再生チューブ基材などに利用できる可能性が示唆された。
公開日・更新日
公開日
2015-09-16
更新日
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