ウイルス性肝炎の病態に応じたウイルス側因子の解明と治療応用

文献情報

• 文献番号: 201227006A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ウイルス性肝炎の病態に応じたウイルス側因子の解明と治療応用
• 課題番号: H22-肝炎-一般-006
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 榎本 信幸(山梨大学 大学院医学工学総合研究部)

研究分担者(所属機関)

• 藤井　秀樹(山梨大学　大学院医学工学総合研究部 )
• 山下　篤哉(山梨大学　大学院医学工学総合研究部 )
• 松本　武久(独立行政法人理化学研究所)
• 朝比奈　靖浩(東京医科歯科大学)
• 黒崎　雅之(武蔵野赤十字病院)
• 坂本　直哉(北海道大学医学研究科)
• 今村　道雄(広島大学病院)
• 中本　安成(福井大学)
• 堀田　博(神戸大学)
• 鈴木　哲朗(浜松医科大学)
• 鈴木　文孝(虎の門病院)
• 中川　美奈(東京医科歯科大学)
• 加藤　直也(東京大学医科学研究所)
• 加藤　宣之(岡山大学大学院)
• 横須賀　收(千葉大学大学院医学研究院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 50,653,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ウイルス性肝炎における治療抵抗性、病態、発癌に関与するウイルス遺伝子変異を明らかとし、病態解明を行うことにより一般診療への標準化を目指すと共に、これらの病態に関与するウイルス側因子を標的とした新規治療法の開発基盤確立を目標とする。

研究方法

肝炎ウイルス全ゲノムダイレクトシークエンス、あるいは次世代シークエンサーによって病態と関連するウイルス構造を、GWAS解析を含む宿主因子を含めた解析を通して明らかとする。さらに肝内遺伝子発現、免疫担当細胞、サイトカインの意義を明らかとし、これらの結果を踏まえ、培養細胞・ヒト肝細胞キメラマウスモデル等の系を用いて、メタゲノムや既存の化合物を含む膨大なライブラリーから高効率に治療抵抗性ウイルスに対する創薬を行う。

結果と考察

ハイスループット全ウイルスゲノム解析により、C型慢性肝炎患者でのペグインターフェロン+リバビリン（P+R）療法においてはIL28Bとコア、ISDR、IRRDRが治療効果を規定する独立因子であることを示した。Deep sequenceによって、わずかなTVR(テラプレビル)耐性NS3変異HCVが多くの症例にQuasispeciesとしてTVR未治療ながら混在し、TVR治療開始後さらに耐性変異率が増加すること、さらにcore 70のquasispeciesと肝癌病態の間には密接な関連があることを示した。NS3-Tyr1082/Gln1112は肝癌発症リスクファクターとして予後診断に有用なことを示した。HCV関連HCCにおけるhetero なHCCの性質を、対応する非癌部発現遺伝子の解析によって分類できる可能性を示した。治療抵抗症例にIL28B minor typeおよびRIG-Iなどの自然免疫系遺伝子やIFN誘導遺伝子の治療前の肝内高発現が関与することを明らかとした。HCC患者において制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が抗腫瘍免疫抑制、がんの進展に作用している可能性を示した。C型慢性肝炎に対するTVRとP+Rの３者併用療法の治療効果は高いこと、NS5A阻害剤とP+R併用療法、NS5A阻害剤とプロテアーゼ阻害剤併用も高い効果が得られること、Ｂ型慢性肝疾患に対する核酸アナログ製剤長期投与では、多剤耐性ウイルスが出現する症例があることを示した。IL-6はC型慢性肝炎における治療抵抗性に加え、肝線維化および肝発癌に関与することを示した。ゲノムワイド関連解析を行い、C型慢性肝炎の進展を規定する宿主因子についてHLA-DRB1/DQA/DQB1の発現量を制御している2つのSNPを見出した。C型慢性肝炎の治療効果予測においてIL28Bに加えて治療前肝細胞内STAT1の核内移行を評価することが有用であること、IL28B SNＰはHCVコア変異や脂質代謝と関連することを示した。IFN あるいはRBVに抵抗性を示す細胞株を樹立、抵抗性細胞内のHCVは遺伝系統樹上クラスターを形成していることを明らかとした。RBV感受性の異なる細胞を用いたcDNAマイクロアレイ解析によりRBV抵抗性の違いで発現レベルの異なる遺伝子を同定した。NS4AアンタゴニストでNS3-4Aプロテアーゼ活性を阻害するACH806またMTP阻害剤でHCV粒子産生を抑制するBMS-201038について長期間添加による耐性ウイルス出現の可能性を検討した。抗NS2化合物を見出し、HCV持続感染細胞へ長期間添加することにより耐性ウイルスが出現すること、アミノ酸981番セリンのグリシンへの置換変異を見出した。C型肝炎患者中HCVのプロテアーゼ阻害剤に対する感受性について酵素活性を指標として評価するため、HCV複製検体からHCV NS3プロテアーゼを簡便に調製しNS5A/5B切断活性を定量する技術開発を行った。抗HCV活性を有する海洋生物抽出物の検索にてウミシダAlloeocomatella polycladiaの酢酸エチル抽出分画、カイメンAmphimedon spの酢酸エチル抽出分画に抗HCV活性があることを見出した。

結論

治療反応性、肝発癌に対するHCV core、NS3、あるいはNS5A遺伝子領域変異の関与が明らかとなる一方、IL28Bの病態への関与も示された。また創薬に関して酵素活性を指標にした抗ウイルス剤スクリーニングの系を確立しつつある。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201227006B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ウイルス性肝炎の病態に応じたウイルス側因子の解明と治療応用
• 課題番号: H22-肝炎-一般-006
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 榎本 信幸(山梨大学 大学院医学工学総合研究部)

研究分担者(所属機関)

• 藤井　秀樹(山梨大学　大学院医学工学総合研究部)
• 山下　篤哉(山梨大学　大学院医学工学総合研究部)
• 松本　武久(独立行政法人理化学研究所)
• 朝比奈　靖浩(東京医科歯科大学)
• 黒崎　雅之(武蔵野赤十字病院)
• 坂本　直哉(北海道大学医学研究科)
• 今村　道雄(広島大学病院)
• 中本　安成(福井大学)
• 堀田　博(神戸大学)
• 鈴木　哲朗(浜松医科大学)
• 鈴木　文孝(虎の門病院)
• 中川　美奈(東京医科歯科大学)
• 加藤　直也(東京大学医科学研究所)
• 加藤　宣之(岡山大学大学院)
• 横須賀　收(千葉大学大学院医学研究院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ウイルス性肝炎における治療抵抗性、病態、発癌に関与するウイルス遺伝子変異を明らかとし、病態解明を行うことにより一般診療への標準化を目指すと共に、これらの病態に関与するウイルス側因子を標的とした新規治療法の開発基盤確立を目標とする。

研究方法

肝炎ウイルス全ゲノムダイレクトシークエンス、あるいは次世代シークエンサーによって病態と関連するウイルス構造を、GWAS解析を含む宿主因子を含めた解析を通して明らかとする。さらに肝内遺伝子発現、免疫担当細胞、サイトカインの意義を明らかとし、これらの結果を踏まえ、培養細胞・ヒト肝細胞キメラマウスモデル等の系を用いて、メタゲノムや既存の化合物を含む膨大なライブラリーから高効率に治療抵抗性ウイルスに対する創薬を行う。

結果と考察

ハイスループット全ウイルスゲノム解析により、C型慢性肝炎患者でのペグインターフェロン+リバビリン（P+R）療法においてはIL28Bとコア、ISDR、IRRDRが治療効果を規定する独立因子であることを示した。Deep sequenceによって、わずかなTVR(テラプレビル)耐性NS3変異HCVが多くの症例にQuasispeciesとしてTVR未治療ながら混在し、TVR治療開始後さらに耐性変異率が増加すること、さらにcore 70のquasispeciesと肝癌病態の間には密接な関連があることを示した。NS3-Tyr1082/Gln1112は肝癌発症リスクファクターとして予後診断に有用なことを示した。HCV関連HCCにおけるhetero なHCCの性質を、対応する非癌部発現遺伝子の解析によって分類できる可能性を示した。治療抵抗症例にIL28B minor typeおよびRIG-Iなどの自然免疫系遺伝子やIFN誘導遺伝子の治療前の肝内高発現が関与することを明らかとした。HCC患者において制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）および骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が抗腫瘍免疫抑制、がんの進展に作用している可能性を示した。C型慢性肝炎に対するTVRとP+Rの３者併用療法の治療効果は高いこと、NS5A阻害剤とP+R併用療法、NS5A阻害剤とプロテアーゼ阻害剤併用も高い効果が得られること、Ｂ型慢性肝疾患に対する核酸アナログ製剤長期投与では、多剤耐性ウイルスが出現する症例があることを示した。IL-6はC型慢性肝炎における治療抵抗性に加え、肝線維化および肝発癌に関与することを示した。ゲノムワイド関連解析を行い、C型慢性肝炎の進展を規定する宿主因子についてHLA-DRB1/DQA/DQB1の発現量を制御している2つのSNPを見出した。C型慢性肝炎の治療効果予測においてIL28Bに加えて治療前肝細胞内STAT1の核内移行を評価することが有用であること、IL28B SNＰはHCVコア変異や脂質代謝と関連することを示した。IFN あるいはRBVに抵抗性を示す細胞株を樹立、抵抗性細胞内のHCVは遺伝系統樹上クラスターを形成していることを明らかとした。RBV感受性の異なる細胞を用いたcDNAマイクロアレイ解析によりRBV抵抗性の違いで発現レベルの異なる遺伝子を同定した。NS4AアンタゴニストでNS3-4Aプロテアーゼ活性を阻害するACH806またMTP阻害剤でHCV粒子産生を抑制するBMS-201038について長期間添加による耐性ウイルス出現の可能性を検討した。抗NS2化合物を見出し、HCV持続感染細胞へ長期間添加することにより耐性ウイルスが出現すること、アミノ酸981番セリンのグリシンへの置換変異を見出した。C型肝炎患者中HCVのプロテアーゼ阻害剤に対する感受性について酵素活性を指標として評価するため、HCV複製検体からHCV NS3プロテアーゼを簡便に調製しNS5A/5B切断活性を定量する技術開発を行った。抗HCV活性を有する海洋生物抽出物の検索にてウミシダAlloeocomatella polycladiaの酢酸エチル抽出分画、カイメンAmphimedon spの酢酸エチル抽出分画に抗HCV活性があることを見出した。

結論

治療反応性、肝発癌に対するHCV core、NS3、あるいはNS5A遺伝子領域変異の関与が明らかとなる一方、IL28Bの病態への関与も示された。また創薬に関して酵素活性を指標にした抗ウイルス剤スクリーニングの系を確立しつつある。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201227006C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: C型慢性肝炎のPeginterferon/RibavirinさらにPeginterferon/Ribavirin/TPV(テラプレビル)治療効果はIL28B、Core・ISDR・IRRDRと著明な関連があることを明らかとした。TVR耐性NS3変異HCVが多くの症例に混在し、治療後さらが増加すること、core 70のquasispeciesと肝癌病態の間には密接な関連があることを示した。病態進展を規定する宿主因子についてHLA-DRB1/DQA/DQB1の発現量を制御する2つのSNPを見出した。
• 臨床的観点からの成果: HCV全ゲノム解析およびdeep sequence解析で得られたHCV NS3A、NS5A、Core70番アミノ酸変異ならびにIL28B TTと治療効果の関連、さらにcore 70と発癌の密接な関連は実地臨床における治療方針決定上、大きなインパクトをもたらす指標となっている。また創薬にむけて薬剤開発のため数種類の系を開発しており今後の進展が期待できる。
• ガイドライン等の開発: HCVコア蛋白変異、NS5A変異およびIL28B多型検査によるpeginterferon/ribavirin治療効果予測アルゴリズムについては本研究で開発ならびに多数症例の検討を行いその有効性を検証した。今後TVRを含む新世代治療においてもガイドラインを開発して広く一般臨床での普及を図る予定としている。
• その他行政的観点からの成果: C型慢性肝炎に対する抗ウイルス治療を普及させて肝癌を予防することは国民的課題となっているが実際には種々の理由で十分に治療がなされていない。その理由の一つは長期に副作用の多い治療を行っても治療効果が不確実であり患者が治療に踏み切れないことにある。したがってウイルスおよび宿主遺伝子解析による確実な治療効果予測は患者からの要望が非常に強く、また確実に効果の期待できる場合に治療を積極的に行うことは医療資源の有効活用の観点からも重要である。
• その他のインパクト: HCVコア変異、NS5A変異およびIL28B多型検査によるpeginterferon/ribavirin治療効果予測アルゴリズムについては学会発表、国内外医学誌への掲載、医師向け講座および市民講座などでの紹介を積極的に行って普及を図っており、さらにTVRを含む新世代治療に関してもアルゴリズムを確立しつつある。山梨県ではこれらの項目について検査体制を整え、肝炎診療連携拠点病院を中心に実地臨床にすでに導入している。さらに検証を重ねガイドラインとしての提供、全国への展開を図る予定としている。

発表件数

• 原著論文（和文）: 7件
• 原著論文（英文等）: 278件
• その他論文(和文): 42件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 72件
• 学会発表(国際学会等): 262件
• その他成果(特許の出願): 1件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: C型肝炎ウイルス株の評価方法及びその利用
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2010-206800 ; 発明者名: 堀田博 ; 権利者名: 堀田博 ; 出願年月日: 20100915 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Urabe Y, Ochi H, Kato N, et al; A genome-wide association study of HCV-induced liver cirrhosis in the Japanese population identifies novel susceptibility loci at the MHC region; J Hepatol , 58 (5) , 875-882 (2013)
• 原著論文2: Shindo H, Maekawa S, Komase K, et al; IL-28B (IFN-lambda3) and IFN-alpha synergistically inhibit HCV replication; J Viral Hepat , 20 (4) , 281-289 (2013)
• 原著論文3: Shi N, Hiraga N, Imamura M, et al; Combination therapies with NS5A, NS3 and NS5B inhibitors on different genotypes of hepatitis C virus in human hepatocyte chimeric mice; Gut , 15 (1) (2013)
• 原著論文4: Nitta S, Sakamoto N, Nakagawa M, et al; Hepatitis C virus NS4B protein targets STING and abrogates RIG-I-mediated type I interferon-dependent innate immunity; Hepatology , 57 (1) , 46-85 (2013)
• 原著論文5: Sejima H, Mori K, Ariumi Y, Ikeda M, Kato N; Identification of host genes showing differential expression profiles with cell-based long-term replication of hepatitis C virus RNA; Virus Res , 167 (6) , 74-85 (2012)
• 原著論文6: Maekawa S, Sakamoto M, Miura M, et al; Comprehensive analysis for viral elements and interleukin-28B polymorphisms in response to pegylated interferon plus ribavirin therapy in hepatitis C virus 1B infection; Hepatology , 56 (11) , 1611-1621 (2012)
• 原著論文7: Kurosaki M, Hiramatsu N, Sakamoto M, et al; Age and total ribavirin dose are independent predictors of relapse after interferon therapy in chronic hepatitis C revealed by data mining analysis; Antivir Ther , 17 (1) , 35-43 (2012)
• 原著論文8: Fujimoto Y, Salam KA, Furuta A, et al; Inhibition of both protease and helicase activities of hepatitis C virus NS3 by an ethyl acetate extract of marine sponge Amphimedon sp; PLoS One , 7 (2012)
• 原著論文9: El-Shamy A, Shoji I, Kim SR, et al; Sequence heterogeneity in NS5A of hepatitis C virus genotypes 2a and 2b and clinical outcome of pegylated-interferon/ribavirin therapy; PLoS One , 7 (2012)
• 原著論文10: Asahina Y, Tsuchiya K, Muraoka M, et al; Association of gene expression involving innate immunity and genetic variation in interleukin 28B with antiviral response; Hepatology , 55 (1) , 20-29 (2012)
• 原著論文11: Mizukoshi E, Nakamoto Y, Arai K, et al; Comparative analysis of various tumor-associated antigen-specific t-cell responses in patients with hepatocellular carcinoma; Hepatology , 53 (4) , 1206-1216 (2011)
• 原著論文12: Miyamura T, Kanda T, Nakamoto S, et al; Hepatic STAT1-nuclear translocation and interleukin 28B polymorphisms predict treatment outcomes in hepatitis C virus genotype 1-infected patients; PLoS One , 6 (2011)
• 原著論文13: Miura M, Maekawa S, Kadokura M, et al; Analysis of viral amino acids sequences and the IL28B SNP influencing the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C; Hepatol Int , 17 (8) , 386-396 (2011)
• 原著論文14: Kumar V, Kato N, Urabe Y, et al; Genome-wide association study identifies a susceptibility locus for HCV-induced hepatocellular carcinoma; Nat Genet , 43 (5) , 455-458 (2011)
• 原著論文15: Hiraga N, Abe H, Imamura M, et al; Impact of viral amino acid substitutions and host interleukin-28b polymorphism on replication and susceptibility to interferon of hepatitis C virus; Hepatology , 54 (9) , 764-771 (2011)
• 原著論文16: Funaoka Y, Sakamoto N, Suda G, et al; Analysis of interferon signaling by infectious hepatitis C virus clones with substitutions of core amino acids 70 and 91; J Virol , 85 (6) , 5986-5994 (2011)
• 原著論文17: Suzuki F, Suzuki Y, Akuta N, et al; Sustained virological response in a patient with chronic hepatitis C treated by monotherapy with the NS3-4A protease inhibitor telaprevir; J Clin Virol , 47 (1) , 76-78 (2010)
• 原著論文18: Suzuki F, Akuta N, Suzuki Y, et al; Efficacy of switching to entecavir monotherapy in Japanese lamivudine-pretreated patients; J Gastroenterol Hepatol , 25 (5) , 892-898 (2010)
• 原著論文19: Masaki T, Suzuki R, Saeed M, et al; Production of infectious hepatitis C virus by using RNA polymerase I-mediated transcription; J Virol , 84 (6) , 5824-5835 (2010)
• 原著論文20: Asahina Y, Tsuchiya K, Tamaki N, et al; Effect of aging on risk for hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C virus infection; Hepatology , 52 (8) , 518-527 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: 2017-01-20

収支報告書

• 文献番号: 201227006Z