人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の実用化を目指す研究

文献情報

• 文献番号: 201407018A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の実用化を目指す研究
• 課題番号: H24-創薬総合-一般-009
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 酒井 宏水(公立大学法人奈良県立医科大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 小田切　優樹(崇城大学　薬学部)
• 東　寛(旭川医科大学　医学部)
• 高瀬　凡平(防衛医科大学校病院　集中治療部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 15,680,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、人工赤血球(ヘモグロビン小胞体, Hb-V)製剤について、効率の高い製造法を確立するとともに、輸血代替(出血性ショック蘇生液)として大量投与する際の安全性項目(特に細網内皮系や免疫系、心血管系への影響)を動物実験により精査し、GMP製剤による非臨床・臨床試験に備えることを目的とした。また、臓器保存液としての可能性を動物実験から明らかにすることも目指した。平成26年度は最終年度として次の項目を検討した。

研究方法

１）混錬法を用いる製造プロセスを継続して検討した。２）片肺切除出血ラットモデルを用い、人工赤血球の投与による蘇生を行なった。３）ラット切断下肢を人工赤血球分散液で8時間灌流する試験において、再接合術を行ったあとラットの歩行状態を観察した。４）各種展示会での展示、「創薬ナビ」を活用、血液製剤製造企業数社へ打診した。またPMDAの事前面談を受けた。５）高脂血症モデルのApoE欠損マウス (B6. KOR/StmSlc-Apoeshlマウス) に静脈内単回投与し安全性を評価した。６）ラットに人工赤血球を投与した後の脾細胞は、一過性のT細胞増殖抑制効果が観察され、この抑制効果発現にはNOの産生が関与することに関連し、TGF-β1の産生動態と自然免疫応答への影響を検討する目的でLPS刺激に対するIL-1β産生能への影響について検討した。７）T細胞増殖抑制効果が誘導されるリポソームの最小投与量の詳細を検討した。８）致死性出血性モデルラットに対し、Hb-V分散液を投与し、蘇生率、心臓電気生理学的変化・致死性不整脈発生予防率、心臓超音波法により心臓機能を比較検討した。

結果と考察

１）混錬法を用いるHb溶液の内包プロセスについて継続して検討し、脂質量40g, 高純度高濃度Hb溶液140 mLをもとに、短時間の混錬操作で約300mLのHb小胞体を繰り返し製造できた。製造法および分析法についてSOPを作成した。２）片肺切除出血ラットモデルを用い、人工赤血球による蘇生を行ない、動脈血圧と動脈血酸素分圧、血中乳酸値のより、呼吸機能が低下した肺切除下のラットにおいてもHb-V投与は保存赤血球輸血と同等の値を示した。３）ラット切断下肢を人工赤血球分散液で8時間灌流し、再接合術を行なったあと、歩行が出来るまで機能回復したことを確認した。４）PMDAの事前面談、医薬基盤研究所の「創薬ナビ」を受け、製造工程や非臨床試験プロトコル作成について助言を得た。実施企業を探索する活動を行なったが、見出すことは出来なかった。開発に向けて克服すべき課題が明確になり、また本製剤の有用性は疑いの無いものと判断し、次年度も公的資金を得て開発を継続するための準備を開始した。５）高脂血症モデルのApoE欠損マウス (B6. KOR/StmSlc-Apoeshlマウス) に静脈内単回投与したところ、体重、血球数に著変はなく、AST, ALTは一日後に上昇したがその後は正常値に復した。血中脂質成分濃度は1, 3日後に上昇したが7日後には正常値に戻り、脂質代謝異常時においてもHbVは十分な代謝・排泄性を持っていた。６）TGF-β1の産生動態と自然免疫応答への影響を検討する目的でLPS刺激に対するIL-1β産生能への影響について検討した結果,リポソーム投与によるTGF-β1の産生増加は観察されなかった。また、LPS刺激によるIL-1β産生動態も特段の変化のない事が示された。７）T細胞増殖抑制効果が誘導されるリポソームの最小投与量をさらに検討し、循環血液量の5%v/v相当の投与量では、抑制効果が認められるが、1%v/vではほぼ完全に抑制効果が認められなかった。８）致死性出血性モデルラットに対しHb-Vを投与し、蘇生率、心臓電気生理学的変化・致死性不整脈発生予防率、心臓機能を比較検討し、赤血球の投与と同等の効果が認められた。

結論

平成26年度は、人工赤血球の効率の高い製造法を確立し、分析法も合わせSOPを作成し、GMP製造に備えることができた。また、細網内皮系へ捕捉された後の影響について精査し、代謝排泄系への問題が無いこと、免疫系に対しても重篤な影響は無いことを確認した。出血性ショック蘇生液としてのみならず、臓器保存灌流液としての新しい可能性も具体化した。本製剤が有用であることは明らかであり、引続き日本医療研究開発機構の研究費を得て実用化に向け橋渡し研究を継続する予定である。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-25
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201407018B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 人工赤血球（ヘモグロビン小胞体）製剤の実用化を目指す研究
• 課題番号: H24-創薬総合-一般-009
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 酒井 宏水(公立大学法人奈良県立医科大学 医学部)

研究分担者(所属機関)

• 小田切　優樹(崇城大学　薬学部)
• 東　寛(旭川医科大学　医学部)
• 高瀬　凡平(防衛医科大学校病院　集中治療部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、人工赤血球(ヘモグロビン小胞体, Hb-V)製剤について、効率の高い製造法を確立するとともに、輸血代替(出血性ショック蘇生液)として大量投与する際の安全性項目(特に細網内皮系や免疫系、心血管系への影響)を動物実験により精査し、GMP製剤による非臨床・臨床試験に備えることを目的とした。また、CO運搬体や臓器保存液としての可能性を動物実験から明らかにし、臨床研究の可能性を見極めることも目指した。

研究方法

Hb-V製造法において、Hbのカプセル化効率を向上させるため混錬法の最適条件を検討した。また脱一酸化炭素法、脱酸素化についても効率を上げる方法を検討した。製剤およびHb原薬の無菌試験法を日本薬局方に従った方法により行った。輸血代替としての安全性評価としては、カニクイザルまでを対象とした動物投与試験により細網内皮系への取り込みによる代謝、免疫系への影響の精査を行った。また、効能と心筋系への影響の精査に関しては、出血性ショック蘇生モデル動物を用いて行った。臓器保存液としての可能性を見出すため、ラット切断下肢灌流モデルを用いた。CO運搬体としての効果について、肺線維化モデルを用いて検討した。産学連携を目指し、様々な展示会への出展や関連学会でシンポジウムを開催するなどして実施企業の探索を行った。

結果と考察

1. 人工赤血球製剤の製造法の確立：　(i) 混錬法によりHb-Vを繰返し製造し、混錬条件の最適化を行い、内包効率が一定して60%近くを得る条件を見出し、SOPを作成した。また、物性分析法についてもSOPを作成した。(ii) Hb-Vの無菌化工程について多角的に検討し、原料導入から無菌的雰囲気を維持して製造することで、最終製剤の無菌性を担保することができた。(iii)人工赤血球製剤500 mL/バッチを繰返し製造でき、このスケールでfirst-in-humanは達成出来ると考え、GMP製造受託候補企業と今後に向けて準備を開始した。また、PMDA事前面談で製造に関する助言を得た。

2. 輸血代替としての人工赤血球製剤の安全性と有効性： (i) 周術期出血モデル(マウス・肺切除)にて有効性を確認、HIF1α発現の低減も酸素運搬効果を支持した(論文投稿中)。ラットの試験に移行し、効果を見出した。(ii) カニクイザル単回投与、一般毒性、血中半減期を明らかにした。(iii) 出血性ショックモデルラットにHb-Vを3回連投し、血中滞留性を比較。1回目投与時に比べ、2回目、3回目投与時ではRES飽和により血中滞留性は向上した。(iv) CO結合Hb-Vの投与が活性酸素種産生の低減と炎症の緩和に有用であった。(v) 高脂血症モデル動物への投与では、血液生化学で脂質関連の数値が一過性に上昇したが、十分な代謝排泄性を示した。(vi) 投与後のラット脾Ｔ細胞の一過性増殖抑制について、発現の増強を認めるmRNA遺伝子を見出したが、蛋白レベルでの明らかな増強を確認できたものは無かった。Con A刺激により、Mip-1α, RANTES, Mip-3α, TNF-α, IFN-γ, IL-10 の増強傾向があるが、自然免疫系IL-1β, IL-8の増強は無かった。(vii) 出血性ショック心臓に特徴的な致死性不整脈の発生抑制に関し、Hb-Vは洗浄赤血球と同等の効果を示した。(viii) ラット切断下肢をHb-Vで6時間灌流した後に、大腿動静脈および大腿神経を吻合し、切断肢再接着術を実施した。灌流中の組織酸素代謝が認められ、3ヶ月後に機能回復も見られた。

3. その他：(i) 人工赤血球の原料として廃棄血を利用しているので、プリオンの混入の可能性に対する考え方をまとめた。(ii) 人工赤血球をがん患者に投与すること、あるいは臓器保存液として使用する場合について、臨床研究(案)の作成に着手した。

結論

人工赤血球の効率の高い製造法を確立し、分析法も合わせSOPを作成し、GMP製造に備えることができた。また、細網内皮系へ捕捉された後の影響について精査し、代謝排泄系への問題が無いこと、免疫系に対しても重篤な影響は無いことを再確認した。CO運搬体としての効果、臓器保存灌流液としての新しい可能性も明らかにすることができた。本製剤が有用であることは疑いの無いことと判断し、引続き日本医療研究開発機構の研究費を得て橋渡し研究を継続する準備を開始した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-25
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201407018C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 人工赤血球(Hb小胞体)の効率の高い製造法を確立し、分析法も合わせSOPを作成し、GMP製造に備えた。安全性に関し、細網内皮系へ捕捉された後の影響について精査し、代謝排泄系、免疫系、心筋系に対しても重篤な影響は無いことを確認した。CO運搬体としての効果、臓器保存灌流液としての可能性も明らかにした。実施製薬企業を見出すには至っていないが、本製剤が有用であることは疑いの無いことと判断し、引続きAMED委託研究開発費(2015-2020)を獲得しGLP非臨床安全性試験を進め橋渡し研究を継続している。
• 臨床的観点からの成果: 以下に記述することは、動物実験による成果をもとに、臨床的にも十分に予想される利点である。感染源を含まず、血液型が無く、長期間備蓄が可能な人工赤血球が実用化された場合に、臨床的に大きな貢献をするものと期待される。（１）室温で備蓄可能なことから、(遠隔地においても)、致死的大量出血への緊急対応が可能である。（２）腫瘍酸素化により腫瘍の放射線感受性の増大が期待できる。（３）臓器保存のための、酸素運搬能を有する理想的な灌流液として応用できる。（４）脳梗塞に至る領域を縮小する事が可能である。
• ガイドライン等の開発: 該当なし
• その他行政的観点からの成果: 2002年改正薬事法：衆議院厚生労働委員会決議には、「五. 人工血液についてはその有効性および安全性が確保されたものの製品化が促進されるよう、研究開発の促進をはかること」が明記された。この方針のもと人工赤血球を開発し、輸血代替としての有効性と安全性を動物試験から明らかにした。将来的に、献血者の「善意」を無駄にせず廃棄血を有効利用すること、国民が高度な医療サービスを享受し、国民の安心・安全の向上を目指すことは、厚生労働省の政策と合致し、更に医療の地域間較差を是正する地域振興施策にも貢献しうる。
• その他のインパクト: NHK「サイエンスZERO」(2012)；日第20回本血液代替物学会年次大会(2013)；第62回日本輸血・細胞治療学会総会シンポジウム「輸血治療を補完する人工赤血球製剤の効力と安全性」2014；平27-29、AMED臨床研究・治験推進研究事業「備蓄・緊急投与が可能な人工赤血球製剤の実用化を目指す研究」平30-令和2、AMED 革新的医療シーズ実用化研究事業「備蓄・緊急投与が可能な人工赤血球製剤の臨床への橋渡し研究」

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 17件
• その他論文(和文): 9件
• その他論文(英文等): 10件
• 学会発表(国内学会): 56件
• 学会発表(国際学会等): 13件
• その他成果(特許の出願): 1件
• その他成果(特許の取得): 1件
• その他成果(施策への反映): 1件
• その他成果(普及・啓発活動): 4件

特許

• 特許の名称: 小胞体の製造法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2012/59233 ; 発明者名: 酒井宏水 ; 権利者名: 早稲田大学 ; 出願年月日: 20120404 ; 国内外の別: 米、印、中、欧、日

• 特許の名称: ヘモグロビンのメト化抑制能を有する人工赤血球
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2016-040494 ; 発明者名: 酒井宏水ほか ; 権利者名: 奈良県立医科大学 ; 出願年月日: 20160302 ; 国内外の別: 日

• 特許の名称: 配位子置換型輸液製剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 5020525 ; 発明者名: 酒井宏水ほか ; 権利者名: 財団法人生産開発科学研究所 ; 出願年月日: 20060330 ; 取得年月日: 20120905 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: メト化防止剤を含有する人工酸素運搬体
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 4763265 ; 発明者名: 酒井宏水ほか ; 権利者名: 奈良県立医科大学 ; 出願年月日: 20041025 ; 取得年月日: 20110831 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 安定保存可能な酸素輸液剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 3466516 ; 発明者名: 酒井宏水ほか ; 権利者名: 奈良県立医科大学 ; 出願年月日: 19990907 ; 取得年月日: 20030524 ; 国内外の別: 米、日

• 特許の名称: 小胞体の製造法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 6061343 ; 発明者名: 酒井宏水 ; 権利者名: 早稲田大学 ; 出願年月日: 20120404 ; 取得年月日: 20161222 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Y. Seishi, H. Horinouchi, H. Sakai, K. Kobayashi; Effect of the cellular-type artificial oxygen carrier Hb-vesicle as a resuscitative fluid for pre-hospital treatment: Experiments in a rat uncontrolled hemorrhagic shock model. ; Shock , 38 , 153-158 (2012); 10.1097/SHK.0b013e31825ad7cf
• 原著論文2: H. Sakai, Y. Suzuki, K. Sou, M. Kano; Cardiopulmonary hemodynamic responses to the small injection of hemoglobin-vesicles (artificial oxygen carriers) in miniature pigs.; J. Biomed. Mater. Res. A , 100 , 2668-2677 (2012); 10.1002/jbm.a.34208
• 原著論文3: K. Taguchi, H. Watanabe, H. Sakai, H. et al.; Fourteen-days observation and pharmacokinetic evaluation after massive intravenous infusion of hemoglobin-vesicles (artificial oxygen carriers) in cynomolgus monkeys.; J. Drug Metab. Toxicol. , 3 , 1000128 - (2012); 10.4172/2157-7609.1000128
• 原著論文4: H. Sakai, K. Ng, B. Li, N. Sugimura.; Swine hemoglobin as a potential source of artificial oxygen carriers, hemoglobin-vesicles. ; Artif. Cells Nanomedicine Biotechnol. , 41 , 37-41 (2013); 10.3109/10731199.2012.716067
• 原著論文5: M. Fujihara, D. Takahashi, H. Abe, et al.; Primary and secondary immune responses to keyhole limpet hemocyanin in rats after the infusion of hemoglobin vesicle, an artificial oxygen carrier.; Artif. Organs , 38 , 234-238 (2014); 10.1111/aor.12148
• 原著論文6: S. Nagao, K. Taguchi, H. Sakai, et al.; Carbon monoxide-bound hemoglobin-vesicles as a potential therapeutic agent for the treatment of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.; Biomaterials , 35 , 6553-6562 (2014); 10.1016/j.biomaterials.2014.04.049
• 原著論文7: H. Sakai, B. Li, W. Lim, Y. Iga. ; Red blood cells donate electrons to methylene blue mediated chemical reduction of methemoglobin compartmentalized in liposome in blood. ; Bioconjugate Chem. , 25 , 1301-1310 (2014); 10.1021/bc500153x
• 原著論文8: J. Araki, H. Sakai, D. Takeuchi, et al.; Normothermic preservation of the rat hind limb with artificial oxygen-carrying hemoglobin vesicles.; Transplantation , 99 , 687-692 (2015); 10.1097/TP.0000000000000528
• 原著論文9: K. Kettisen, L. Bulow, H. Sakai; Potential electron mediators to extract electron energies of RBC glycolysis for prolonged in vivo functional lifetime of hemoglobin vesicles; Bioconjugate Chem. , 26 , 746-754 (2015); 10.1021/acs.bioconjchem.5b00076
• 原著論文10: Taguchi K, Nagao S, Yamasaki K, Sakai H, et al.; Biological Responsiveness and Metabolic Performance of Liposome-Encapsulated Hemoglobin (Hemoglobin-Vesicles) in Apolipoprotein E-Deficient Mice after Massive Intravenous Injection.; Biol Pharm Bull. , 38 (10) , 1606-1616 (2015); 10.1248/bpb.b15-00420
• 原著論文11: Li H, Ohta H, Tahara Y, Nakamura S, et al.; Artificial oxygen carriers rescue placental hypoxia and improve fetal development in the rat pre-eclampsia model.; Sci. Rep. , 5 , 15271- (2015); 10.1038/srep15271.
• 原著論文12: Nagao S, Taguchi K, Miyazaki Y, Wakayama T, et al.; Evaluation of a new type of nano-sized carbon monoxide donor on treating mice with experimentally induced colitis.; J Control Release. , 234 , 49-58 (2016); 10.1016/j.jconrel.2016.05.016
• 原著論文13: Tokuno M, Taguchi K, Yamasaki K, Sakai H, et al.; Long-Term Stored Hemoglobin-Vesicles, a Cellular Type of Hemoglobin-Based Oxygen Carrier, Has Resuscitative Effects Comparable to That for Fresh Red Blood Cells in a Rat Model with Massive Hemorrhage without Post-Transfusion Lung Injury.; PLoS One , 11 (10) , e0165557- (2016); 10.1371/journal.pone.0165557
• 原著論文14: Nagao S, Taguchi K, Sakai H, Yamasaki K, Watanabe H, Otagiri M, Maruyama T; Carbon monoxide-bound hemoglobin vesicles ameliorate multiorgan injuries induced by severe acute pancreatitis in mice by their anti-inflammatory and antioxidant properties.; Int J Nanomedicine. , 11 , 5611-5620 (2016); 10.2147/IJN.S118185
• 原著論文15: Rikihisa N, Watanabe S, Satoh K, Saito Y, Sakai H; Photosensitizer Effects of Artificial Red Cells on Dye Laser Irradiation in an Animal Model Assuming Port-Wine Stain Treatment.; Plast Reconstr Surg. , 139 (3) , 707e-716e (2017); 10.1097/PRS.0000000000003082.
• 原著論文16: Azuma H, Yoshida Y, Takahashi H, Ishibazawa E, Kobayashi H, Sakai H, Takahashi D, Fujihara M.; Liposomal microparticle injection can induce myeloid-derived suppressor cells (MDSC)-like cells in vivo.; Immunopharmacol Immunotoxicol. , 39 (3) , 140-147 (2017); 10.1080/08923973.2017.1306867.
• 原著論文17: Kohno M, Ikeda T, Hashimoto R, Izumi Y, Watanabe M, Horinouchi H, Sakai H, Kobayashi K, Iwazaki M.; Acute 40% exchange-transfusion with hemoglobin-vesicles in a mouse pneumonectomy model.; PLos One , 12 , e0178724- (2017); 10.1371/journal.pone.0178724.
• 原著論文18: Hagisawa K, Kinoshita M, Takase B, Hashimoto K, Smith D, Seki S, Nishida Y, Sakai H.; EFFICACY OF RESUSCITATIVE TRANSFUSION WITH HEMOGLOBIN VESICLES IN THE TREATMENT OF MASSIVE HEMORRHAGE IN RABBITS WiTH THROMBOCYTOPENIC COAGULOPATHY AND ITS EFFECT ON HEMOSTASIS BY PLATELET TRANSFUSION; Shock , 50 (3) , 324-330 (2018); 10.1097/SHK.0000000000001042
• 原著論文19: Naoaki Rikihisa, Mai Tominaga, Shoji Watanabe, Nobuyuki Mitsukawa, Yoshiaki Saito, Hiromi Sakai; Intravenous injection of artificial red cells and subsequent dye laser irradiation causes deep vessel impairment in an animal model of port-wine stain; Lasers in Medical Science , 33 , 1287-1293 (2018); 10.1007/s10103-018-2480-2

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2019-05-23

収支報告書

• 文献番号: 201407018Z