ヒトがんにおけるエピジェネティックな異常の解明と応用に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201313002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒトがんにおけるエピジェネティックな異常の解明と応用に関する研究
• 課題番号: H22-３次がん-一般-002
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 牛島 俊和(独立行政法人国立がん研究センター 研究所 エピゲノム解析分野)

研究分担者(所属機関)

• 金井　弥栄(独立行政法人国立がん研究センター　研究所　分子病理分野)
• 鈴木　拓(札幌医科大学　医学部　分子生物学講座)
• 伊東　文生(聖マリアンナ医科大学　医学部　消化器・肝臓内科)
• 山田　泰広(京都大学　iPS細胞研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 46,231,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

DNAメチル化異常は、ヒト発がんに深く関与する。本研究では、DNAメチル化異常誘発の要因や分子機構を明らかにすること、ゲノム網羅的な解析によりDNAメチル化異常を解明、がんの本態を明らかにすること、臨床的に有用な診断方法の開発を行うこと、エピジェネティック治療の基盤を確立することを目的としている。

研究方法

ゲノム領域特異的なDNAメチル化解析は、重亜硫酸処理の後、methylation-specific PCR (MSP)法、定量的MSP法、シークエンス法、pyrosequencing法などにより行った。DNAメチル化の網羅的解析では、BeadArrayやMCAM法などの異なる網羅的解析手法を適切に使い分けた。ゲノム網羅的なヒストン修飾解析はChIP-seq法またはChIP-chip法により行った。

結果と考察

(1) DNAメチル化異常の誘発要因や分子機構
DNAメチル化異常の発がんへの深い関与を考えると、その誘発機構の解明は急務である。本年度は、TMK1細胞株を炎症関連因子であるIL1βで処理することにより、DNAメチル基転移酵素の活性に変化が無いものの、DNA脱メチル化に関与するTET遺伝子群の発現が低下することを見出した。同様の結果は、ピロリ菌に感染したスナネズミ胃粘膜においても認められた。DNAメチル化異常誘発に関与する成分が明らかになれば、その抑制による新たな疾患予防戦略を立てることができると考えられる。また、大腸腫瘍由来の初期化細胞は、Apcのレスキューにより個体への発生が可能であることを明らかにすると共に、マウス生体内で山中４因子を発現させ、その初期化の程度が不十分だとヒトWilms腫瘍と極めて類似した腫瘍が形成されることを見出した。不完全な初期化による発がん過程は遺伝子変異により引き起こされるのではなく、エピジェネティック修飾状態の変化による発がんであることが示唆された。小児がんなど一部のがんでは同様の発がんメカニズムが働いている可能性が考えられた。
(2) がんでのエピジェネティック異常の全体像の解明とがん抑制遺伝子の同定
がん細胞および前がん病変におけるエピゲノム異常の解明は、がんそのものや発がん過程を理解するため、また、これらの異常を臨床応用するための基盤的情報である。本年度は、エピゲノム、ゲノム異常の統合的な解析の結果、胃がんにおいては、ジェネティック、エピジェネティック双方の異常により、がん関連遺伝子経路の異常が形成されていることを示した。また、PKC活性化及び、様々なシグナル経路に関与するDGKG遺伝子が、ヒト大腸がんでDNAメチル化により不活化されているがん抑制遺伝子であることを見出した。
(3) 診断的に有用なDNAメチル化異常の同定
DNAメチル化異常の診断的応用は、実用化段階を迎えている。既に前向き臨床試験（他の研究事業）へと移行した胃がんのリスク診断に加え、CIMP陽性腎細胞がんを判別することによる、腎細胞がん予後診断マーカーパネルを開発した。今年度は検証コホート100例の解析を行い、その有用性を確認した。CIMPマーカー遺伝子を用いた予後診断法の実施に際しては、手術検体から余分な侵襲なく組織検体が採取でき、臨床検査として導入し易いと期待される。神経芽細胞腫の予後診断については、臨床応用に十分な精度があることがわかっており、前向き臨床試験に伴う診断を継続して実施している（累積227例）。胃洗浄廃液でのDNAメチル化解析による胃がんの存在診断について、前向き多施設臨床試験を進めた（３年目）。本試験は順調に進展しており、臨床応用へ向けた大きな一歩となる可能性が考えられた。通常は廃棄される胃洗浄液を用いた胃がんの存在診断が実用化されれば、侵襲度の非常に低い新たな検査法として価値は大きい。
(4) エピジェネティック治療の基盤確立
これまでに開発したDNA脱メチル化剤のハイスループットスクリーニング系を用いて、19,840個の化合物ライブラリー(NPDepo)をスクリーニングし、再現性が確認された４個のヒット化合物を得た。新規のDNAメチル化異常の誘発因子のスクリーニングは、ひいては新規エピジェネティック薬の開発に繋がると考えられる。

結論

公衆衛生上重要なDNAメチル化異常の誘発機構の解明を進めた。がんでの各種遺伝子のDNAメチル化異常の解明は、本態解明に加えて、がんの検出、病態、及び、予後の診断に有用である。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201313002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒトがんにおけるエピジェネティックな異常の解明と応用に関する研究
• 課題番号: H22-３次がん-一般-002
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 牛島 俊和(独立行政法人国立がん研究センター 研究所 エピゲノム解析分野)

研究分担者(所属機関)

• 金井　弥栄(独立行政法人国立がん研究センター　研究所　分子病理分野)
• 豊田　実(札幌医科大学　生化学第二講座)
• 鈴木　拓(札幌医科大学　分子生物学講座)
• 伊東　文生(聖マリアンナ医科大学　消化器肝臓内科)
• 山田　泰広(京都大学　iPS細胞研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 平成23年6月17日に、研究者死亡のため、豊田実（札幌医科大学生化学第二講座・教授）から鈴木拓（札幌医科大学分子生物学講座・教授）に研究者交替をした。新研究者は、これまで旧研究者が行った多くの研究に共同研究者として参加しており、本研究課題に関しても多くの実績がある。

研究報告書（概要版）

研究目的

DNAメチル化異常は、ヒト発がんに深く関与する。本研究では、DNAメチル化異常誘発の要因や分子機構を明らかにすること、ゲノム網羅的な解析によりDNAメチル化異常を解明、がんの本態を明らかにすること、臨床的に有用な診断方法の開発を行うこと、エピジェネティック治療の基盤を確立することを目的としている。

研究方法

ゲノム領域特異的なDNAメチル化解析は、重亜硫酸処理の後、methylation-specific PCR (MSP)法、定量的MSP法、シークエンス法、pyrosequencing法などにより行った。DNAメチル化の網羅的解析では、BeadArrayやMCAM法などの異なる網羅的解析手法を適切に使い分けた。ゲノム網羅的なヒストン修飾解析はChIP-seq法またはChIP-chip法により行った。

結果と考察

(1) DNAメチル化異常の誘発要因や分子機構
DNAメチル化異常の発がんへの深い関与を考えると、その誘発機構の解明は急務である。本研究において、遺伝子のメチル化異常誘発の感受性に、ゲノムの構造であるSINEおよびLINEとの距離が関与していることを明らかにした。DNAメチル化異常誘発には、特定の慢性炎症が重要であること、単球・マクロファージが異常誘発の重要なEffectorである可能性が非常に高いこと、炎症などにより獲得した後天性のH3K27me3異常も、異常の誘因となることを示した。DNAメチル化異常誘発に関与する成分が明らかになれば、その抑制による新たな疾患予防戦略を立てることができると考えられる。また、大腸腫瘍由来の初期化細胞を樹立し、Apcのレスキューにより個体への発生が可能であることを明らかにした。マウス生体内で山中４因子を発現させ、その初期化の程度が不十分だとヒトWilms腫瘍と極めて類似した腫瘍が形成されることを見出した。これらは、エピジェネティック修飾状態ががん細胞の性質決定に非常に重要な役割を果たしていることを示す結果と考えられた。
(2) がんでのエピジェネティック異常の全体像の解明とがん抑制遺伝子の同定
がん細胞および前がん病変におけるエピゲノム異常の解明は、がんそのものや発がん過程を理解するため、また、これらの異常を臨床応用するための基盤的情報である。本研究において、ヒト大腸がん及び胃がんにおいてDNAメチル化異常が誘発されるがん抑制遺伝子, miRNAを複数(ANGPTL4, FHL1, DGKG, miR1-1)同定した。NTSR1遺伝子のように、大腸腺腫では高頻度にメチル化しているが、進行大腸がんでは頻度が低下し、メチル化が浸潤性と逆相関する遺伝子も同定した。また、胃がんにおいて、CpGアイランドメチル化形質(CIMP)とがん遺伝子の変異が関連していることを示した。
(3) 診断的に有用なDNAメチル化異常の同定
DNAメチル化異常の診断的応用は、実用化段階を迎えている。既に前向き臨床試験（他の研究事業）へと移行した胃がんのリスク診断に加え、CIMP陽性腎細胞がんを判別することによる、腎細胞がん予後診断マーカーパネルを開発した。病院における臨床検査としての実用化のために、国内診断機器メーカーと専用機器の共同開発研究を進めている。実用化されれば、再発リスクに応じた術後治療が実施可能になると期待される。神経芽細胞腫の予後診断については、臨床応用に十分な精度があることがわかっており、前向き臨床試験に伴う診断を継続して実施している（累積227例）。さらに、胃洗浄廃液でのDNAメチル化解析による胃がんの存在診断について、前向き多施設臨床試験を進めた（３年目）。通常は廃棄される胃洗浄液を用いた胃がんの存在診断が実用化されれば、侵襲度の非常に低い新たな検査法として価値は大きい。
(4) エピジェネティック治療の基盤確立
新規のDNAメチル化異常の誘発因子のスクリーニングは、新規エピジェネティック薬の開発に繋がる。本研究で、ハイスループットなDNA脱メチル化剤スクリーニング系を確立し、19,840個の化合物ライブラリーのスクリーニングでヒット化合物４個を得た。ライブラリーを拡張することにより、さらに多くのヒット化合物が得られる可能性がある。また、エピジェネティック修飾の組み合わせに注目し、その可視化技術(iChmo)を開発した。がん特異性が高いエピジェネティック修飾の組み合わせを見出すことができれば、エピジェネティック治療に腫瘍特異性をもたらす可能性が示される。

結論

公衆衛生上重要なDNAメチル化異常の誘発機構の解明を進めた。がんでの各種遺伝子のDNAメチル化異常の解明は、本態解明に加えて、がんの検出、病態、及び、予後の診断に有用である。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201313002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 交付申請時の目的である「DNAメチル化異常誘発の要因や分子機構の解明、ゲノム網羅的な解析によるDNAメチル化異常の分離による診断的に有用なマーカーの分離、およびエピジェネティック治療の基盤確立」は順調に達成され、合計73報の英文論文の刊行、国内・国外の学会での177件の発表につながった。特に、発がん以前からエピジェネティック異常が蓄積しているという「エピジェネティックな発がんの素地」を実証した成果は、世界的に評価された。
• 臨床的観点からの成果: エピジェネティックな発がんの素地については臨床研究に発展、リスクマーカーとしての有用性が示された。神経芽細胞腫の予後マーカーについては前向き試験を継続している。腎細胞癌の予後診断マーカー、胃洗浄廃液由来DNAを用いた胃がんの存在診断については、臨床研究の準備中である。
• ガイドライン等の開発: 該当無し
• その他行政的観点からの成果: 該当無し
• その他のインパクト: 本研究の成果である、がんにおけるエピジェネティックな異常の重要性については、以下のマスコミに取り上げられた。; ・TBS番組2013年2月11日 (月) 最新遺伝子ミステリー ”人間とは何だ…?”（牛島班長）; ・NHKニュース 2014年2月14日 (金) がん発生の別のメカニズム突き止める（山田班員）

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 130件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 6件
• 学会発表(国内学会): 97件
• 学会発表(国際学会等): 80件
• その他成果(特許の出願): 5件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 膀胱癌細胞の検出方法、膀胱癌細胞の検出方法に用いるプライマー及び膀胱癌マーカ
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2012/056605 ; 発明者名: 清水崇、鈴木拓、豊田実、塚本泰司 ; 権利者名: 北海道公立大学法人札幌医科大学 ; 出願年月日: 20120314 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 肝細胞癌のリスク評価方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2012/051803 ; 発明者名: 金井弥栄、新井恵吏、長塩亮 ; 権利者名: 独立行政法人国立がん研究センター ; 出願年月日: 20120127 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 浸潤性大腸腫瘍検出用の検体
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2010/064715 ; 発明者名: 豊田実、山本英一郎、神前正幸、鈴木拓、山野泰穂 ; 権利者名: 北海道公立大学法人札幌医科大学 ; 出願年月日: 20100830 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: Method for Detecting Disease-related Marker Using Gastric Mucosal Lavage Fluid
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2007/059953 ; 発明者名: Yoshiyuki Watanabe, Minoru Toyota, Kohzo Imai, Yasuhisa Shinomura, Fumio Itoh, Takashi Tokino ; 権利者名: Sapporo Medical University, St. Marianna University School of Medicine ; 出願年月日: 20070515 ; 国内外の別: 国外

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Takeshima H, Niwa T, Toyoda T, et al.; Degree of methylation burden is determined by the exposure period to carcinogenic factors; Cancer Sci , 108 (3) , 316-321 (2017); doi: 10.1111/cas.13136.
• 原著論文2: Takeshima H, Wakabayashi M, Hattori N, et al.; Identification of co-existence of DNA methylation and H3K27me3 specifically in cancer cells as a promising target for epigenetic therapy; Carcinogenesis , 36 (2) , 192-201 (2015); doi: 10.1093/carcin/bgu238.
• 原著論文3: Okochi-Takada E, Hattori N, Tsukamoto T, et al.; ANGPTL4 is a secreted tumor suppressor that inhibits angiogenesis; Oncogene , 33 (17) , 2273-2278 (2015); doi: 10.1038/onc.2013.174.
• 原著論文4: Ohnishi K, Semi K, Yamamoto T, et al.; Premature termination of reprogramming in vivo leads to cancer development through altered epigenetic regulation; Cell , 156 (4) , 663-677 (2014); doi: 10.1016/j.cell.2014.01.005.
• 原著論文5: Hattori N, Niwa T, Kimura K, et al.; Visualization of multivalent histone modification in a single cell reveals highly concerted epigenetic changes on differentiation of embryonic stem cells; Nucleic Acids Res , 41 (15) , 7231-7239 (2014); doi: 10.1093/nar/gkt528.
• 原著論文6: Asada K, Ando T, Niwa T, et al.; FHL1 on chromosome X is a single-hit gastrointestinal tumor-suppressor gene and contributes to the formation of an epigenetic field defect; Oncogene , 32 (17) , 2140-2149 (2013); doi: 10.1038/onc.2012.228.
• 原著論文7: Kim JG, Takeshima H, Niwa T, et al.; Comprehensive DNA methylation and extensive mutation analyses reveal an association between the CpG island methylator phenotype and oncogenic mutations in gastric cancers; Cancer Lett , 330 (1) , 33-40 (2013); doi: 10.1016/j.canlet.2012.11.022.
• 原著論文8: Niwa T, Toyoda T, Tsukamoto T, et al.; Prevention of Helicobacter pylori-induced gastric cancers in gerbils by a DNA demethylating agent; Cancer Prev Res , 6 (4) , 263-270 (2013); doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-12-0369.
• 原著論文9: Sawada T, Yamamoto E, Suzuki H, et al.; Association between genomic alterations and metastatic behavior of colorectal cancer identified by array-based comparative genomic hybridization; Genes Chromosomes Cancer , 52 (2) , 140-149 (2013); doi: 10.1002/gcc.22013.
• 原著論文10: Hirata A, Utikal J, Yamashita S, et al.; Dose-dependent roles for canonical Wnt signaling in de novo crypt formation and cell cycle properties of the colonic epithelium; Development , 140 (1) , 66-75 (2013); doi: 10.1242/dev.084103.
• 原著論文11: Takeshima H, Ikegami D, Wakabayashi M, et al.; Induction of aberrant trimethylation of histone H3 lysine 27 by inflammation in mouse colonic epithelial cells; Carcinogenesis , 33 (12) , 2384-2390 (2013); doi: 10.1093/carcin/bgs294.
• 原著論文12: Ushijima T, Hattori N; Molecular pathways: involvement of helicobacter pylori-triggered inflammation in the formation of an epigenetic field defect, and its usefulness as cancer risk and exposure markers; Clin Cancer Res , 18 (4) , 923-929 (2012); doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-2011.
• 原著論文13: Katsurano M, Niwa T, Yasui Y, et al.; Early-stage formation of an epigenetic field defect in a mouse colitis model, and non-essential roles of T- and B-cells in DNA methylation induction; Oncogene , 31 (3) , 342-351 (2012); doi: 10.1038/onc.2011.241.
• 原著論文14: Yamamoto E, Suzuki H, Yamano HO, et al.; Molecular dissection of premalignant colorectal lesions reveals early onset of the CpG island methylator phenotype; Am J Pathol , 181 (5) , 1847-1861 (2012); doi: 10.1016/j.ajpath.2012.08.007.
• 原著論文15: Arai E, Chiku S, Mori T, et al.; Single-CpG-resolution methylome analysis identifies clinicopathologically aggressive CpG island methylator phenotype clear cell renal cell carcinomas; Carcinogenesis , 33 (8) , 1487-1493 (2012); doi: 10.1093/carcin/bgs177.
• 原著論文16: Hur K, Niwa T, Toyoda T, et al.; Insufficient role of cell proliferation in aberrant DNA methylation induction, and involvement of specific types of inflammation; Carcinogenesis , 32 (1) , 35-41 (2012); doi: 10.1093/carcin/bgq219.
• 原著論文17: Nagashio R, Arai E, Ojima H, et al.; Carcinogenetic risk estimation based on quantification of DNA methylation levels in liver tissue at the precancerous stage; Int J Cancer , 129 (5) , 1170-1179 (2011); doi: 10.1002/ijc.26061.
• 原著論文18: Suzuki H, Takatsuka S, Akashi H, et al.; Genome-wide profiling of chromatin signatures reveals epigenetic regulation of microRNA genes in colorectal cancer; Cancer Res , 71 (17) , 5646-5658 (2011); doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1076.
• 原著論文19: Niwa T, Tsukamoto T, Toyoda T, et al.; Inflammatory processes triggered by Helicobacter pylori infection cause aberrant DNA methylation in gastric epithelial cells; Cancer Res , 70 (4) , 1430-1440 (2010); doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-2755.
• 原著論文20: Suzuki H, Yamamoto E, Nojima M, et al.; Methylation- associated silencing of microRNA-34b/c in gastric cancer and its involvement in an epigenetic field defect; Carcinogenesis , 31 (12) , 2066-2073 (2010); doi: 10.1093/carcin/bgq203.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-02
• 更新日: 2018-05-22

収支報告書

• 文献番号: 201313002Z
• 報告年月日: 2014年05月30日

収入

• (1)補助金交付額: 60,100,000円
• (2)補助金確定額: 60,100,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	27,429,788円
		人件費・謝金	11,609,925円
		旅費	2,158,832円
		その他	5,032,455円
	間接経費		13,869,000円
	合計		60,100,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2016-08-05
• 更新日: -