AI支援型MPSを用いたヒトiPS由来神経細胞による神経毒性試験法の開発

文献情報

• 文献番号: 202425008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: AI支援型MPSを用いたヒトiPS由来神経細胞による神経毒性試験法の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: 22KD1002
• 研究年度: 令和6(2024)年度
• 研究代表者(所属機関): 安彦 行人(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター薬理部)

研究分担者(所属機関)

• 諫田　泰成(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部)
• 小島　肇(山口東京理科大学　工学部　医薬工学科)
• 松永　民秀(名古屋市立大学　大学院薬学研究科　臨床薬学分野)
• 加藤　竜司(名古屋大学　大学院創薬科学研究科)
• 鈴木　郁郎(東北工業大学　工学部)
• 渋谷　淳(国立大学法人東京農工大学大学院　農学研究院動物生命科学部門)
• 吉成　浩一(東北大学大学院薬学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和4(2022)年度
• 研究終了予定年度: 令和6(2024)年度
• 研究費: 20,433,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

現在、化学物質の発達神経毒性はげっ歯類を用いた行動試験により評価されているが、ヒトへの外挿性や予測性に課題がある。動物試験における3Rsの観点からも、ヒト生体に近い細胞や標本を用いたin vitro評価系や、コンピューターを活用したin silico予測手法の開発が望まれる。本研究はヒトiPS細胞由来の神経細胞及び血液脳関門（BBB）を用いたin vitro評価法の開発、in vitroとin silico手法の統合による新たな発達神経毒性予評価法の開発を目的とする。

研究方法

2層灌流デバイスとMEAをマイクロ流路にて連結したMEA連結型MPSを開発した。この装置の評価のため、既存データが豊富なラット初代培養大脳皮質神経細胞を利用するための培養プロトコルを検討した。前年度まで使用したNeuCyte社のヒトiPS細胞由来神経細胞の安定供給に問題が生じ購入が不可能となったため、本年度は別メーカー（富士フィルムCDI社）の製品を用いて培養およびMEA計測手順の検討を行った。
細胞画像AI解析モデルにおけるノイズデータ影響の検証と最適化を行った。MEA標準の11パラメータに独自に算出した最大発火周波数関連４パラメータを加えて毒性予測AIモデルを作成し、未学習化合物に対して精度検証を実施した。
ヒトiPS細胞由来脳オルガノイドの安定したMEA計測を目的に、基材や培養期間の検討を行った。
In silico毒性予測手法として、食品安全委員会の農薬評価書から作成した独自データベースに記載の350剤について、分子記述子により計算した相互の類似度を用い、コリンエステラーゼ関連所見、神経関連の外観・行動所見の二つのエンドポイントについて、各剤の毒性予測を行った。
ネオニコチノイド系農薬イミダクロプリドについて、OECD発達神経毒性試験ガイドライン(TG426)に従いラット発達期ばく露を行い、脳をサンプリングして免疫組織学的検索、遺伝子発現解析を実施した。またTG426に従い行動試験を行った。

結果と考察

灌流装置とラット神経細胞を播種したMEA装置をマイクロ流路により連結し、培養液の灌流下でMEA計測が可能であることを明らかにした。これによりキネティクスを考慮したMEA計測の実現に前進できた。ヒトiPS細胞由来神経細胞の培養において強い細胞凝集が観察されたが、細胞解凍の際の分散を徹底した結果、凝集はほぼ見られなくなった。この知見はMEAにおける標準的な培養手順の確立に役立つ。MEAデータと細胞画像特徴量の相関をAIにより解析する手法の検討を進め、深層学習技術を用いて画像特徴量をモデル化する等により、安定した解析を行えることが見出された。AIを用いたMEAデータの解析において、最大発火周波数関連の新規４パラメータを予測に用いた結果、良好な神経毒性予測を行うことができた。これらにより、AIを活用したin vitroデータからの神経毒性予測に向けて前進した。
脳オルガノイド作製プロトコルを改良し、3週間にわたり安定したネットワークバーストを得ることに成功した。この知見は脳オルガノイドを用いたin vitro神経毒性予測手法の開発に役立つ。
化学構造式からコンピューターを用いて発達神経毒性を予測する手法として、分子記述子により化学構造の類似した物質の毒性予測を行うリードアクロス手法開発を進めた。in silico生物活性予測値を利用することで予測精度が向上すること、その際には対象とするエンドポイントとの関連性が高い変数を利用することが精度向上に寄与することが示唆された。
発達神経毒性のメカニズムが明らかでない物質として、イミダクロプリドについて発達神経毒性評価を実施した。イミダクロプリドは海馬において神経炎症と酸化ストレスを上昇させ、成体期における神経新生抑制を引き起こすことが示唆された。このような毒性メカニズムを検出するin vitro評価系の重要性が示唆された。

結論

キネティクスを反映した新たなin vitro試験法を目指し、BBBとMEAを連結した生体模倣システムを開発した。ヒトiPS神経を用いて神経ネットワーク活動をMEAにより記録してAI予測モデルを構築したところ、神経毒性の高い予測性を有することを明らかにした。また、化学構造に基づくin silico予測とin vitroデータを統合的に活用することにより、in vivo発達神経毒性の予測性向上を示唆する結果が得られた。In vivo実験により、神経炎症や酸化ストレスによる発達神経毒性メカニズムが示唆された。本研究により、in vitro、in silico手法の統合により発達神経毒性予測性の向上が可能であることが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2025-05-28
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202425008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: AI支援型MPSを用いたヒトiPS由来神経細胞による神経毒性試験法の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: 22KD1002
• 研究年度: 令和6(2024)年度
• 研究代表者(所属機関): 安彦 行人(国立医薬品食品衛生研究所 安全性生物試験研究センター薬理部)

研究分担者(所属機関)

• 諫田　泰成(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部)
• 小島　肇(山口東京理科大学　工学部　医薬工学科)
• 松永　民秀(名古屋市立大学　大学院薬学研究科　臨床薬学分野)
• 加藤　竜司(名古屋大学　大学院創薬科学研究科)
• 鈴木　郁郎(東北工業大学　工学部)
• 渋谷　淳(国立大学法人東京農工大学大学院　農学研究院動物生命科学部門)
• 吉成　浩一(東北大学大学院薬学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和4(2022)年度
• 研究終了予定年度: 令和6(2024)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

現在、化学物質の発達神経毒性はげっ歯類を用いた行動試験により評価されているが、ヒトへの外挿性や予測性に課題がある。動物試験における3Rsの観点からも、ヒト生体に近い細胞や標本を用いたin vitro評価系や、コンピューターを活用したin silico予測手法の開発が望まれる。本研究はヒトiPS細胞由来の神経細胞及び血液脳関門（BBB）を用いたin vitro評価法の開発、in vitroとin silico手法の統合による新たな発達神経毒性予評価法の開発を目的とする。

研究方法

ヒトiPS細胞由来BBBを２機関で培養し、バリア機能のプレバリデーション、神経細胞との共培養が可能な培地の開発を進めた。2層灌流デバイスとMEAをマイクロ流路にて連結したMEA連結型MPSの開発を行った。この装置の評価のため、既存データが豊富なラット初代培養大脳皮質神経細胞を利用するための培養プロトコルを検討した。
AIによる細胞画像解析のため、MEA測定と画像撮影をセットで行いデータを集積した。深層学習モデルによる学習により、細胞画像から特徴量を抽出するアルゴリズムを開発した。画像予測AIモデルロバスト化のための各種処理の最適化およびノイズデータ影響の検証と最適化を行った。
ヒトiPS細胞由来神経細胞の急性毒性MEAデータを解析し、15の神経活動関連パラメータを用いて毒性予測AIモデルを作成し、陰性対照化合物に対する毒性スコアの標準偏差を基準とした毒性判定法を開発した。未学習化合物に対して、作成したAIによる毒性判定を実施し、精度検証を実施した。
ヒトiPS細胞RIKEN-1Aから、培養液キットを用いて脳オルガノイドを作製し、MEA計測を実施した。
In silico毒性予測手法開発のため、発達神経毒性に関する総説に記載された361の化学物質、90日間試験の結果がある350の農薬について分子記述子を計算し、物質間の類似性を算出した。
発達神経毒性のメカニズムが明らかでない化学物質としてフッ化ナトリウム、過塩素酸アンモニウム、イミダクロプリドに着目し、OECD発達神経毒性試験ガイドライン(TG426)に従いラット発達期ばく露を行った。児動物脳について、免疫組織学的検索、遺伝子発現解析を実施した。またTG426に従い行動試験を行った。

結果と考察

BBBの施設間プレバリデーションにより高いバリア機能が確認され、また培養液の灌流下でMEA計測が可能であることを明らかにした。これによりキネティクスを考慮したMEA計測の実現に前進することができた。MEAデータと細胞画像特徴量の相関をAIにより解析する手法の検討を進め、ノイズデータをin silicoで削減、深層学習技術を用いて画像特徴量をモデル化することにより、安定した解析を行えることが見出された。AIを用いたMEAデータの解析において、最大発火周波数と関連する新規パラメータ４つを予測に用いた結果、陰性・陽性両化学物質について良好な神経毒性予測を行うことができた。これらの成果により、AIを活用したin vitroデータからの神経毒性予測に向けて前進した。
MEA計測のための脳オルガノイド作製プロトコルを改良し、3週間にわたり安定したネットワークバーストを得ることに成功した。この知見は脳オルガノイドを用いたin vitro神経毒性予測手法の開発に役立つ。
分子記述子によるリードアクロス手法において、in silico生物活性予測値を変数に追加することで予測精度が向上すること、その際には対象とするエンドポイントとの関連性が高い変数を絞り込んで利用することが精度向上に寄与することが示唆された。
化学物質曝露が海馬において神経炎症と酸化ストレス、またストレスに対する感受性を上昇させ、成体期における多動的行動と進行性の神経新生抑制を引き起こすメカニズムが示唆された。このような毒性メカニズムを検出するin vitro評価系の重要性が示唆された。

結論

キネティクスを反映した新たなin vitro試験法を目指し、BBBとMEAを連結した生体模倣システムを開発した。ヒトiPS神経を用いて神経ネットワーク活動をMEAにより記録してAI予測モデルを構築したところ、神経毒性の高い予測性を有することを明らかにした。また、化学構造に基づくin silico予測とin vitroデータを統合的に活用することにより、in vivo発達神経毒性の予測性向上を示唆する結果が得られた。In vivo実験により、神経炎症や酸化ストレスによる発達神経毒性メカニズムが示唆された。本研究により、in vitro、in silico手法の統合により発達神経毒性予測性の向上が可能であることが示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2025-05-28
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202425008C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: キネティクスを反映した新たなin vitro試験法を目指し、BBBとMEAを連結した生体模倣システムを開発した。ヒトiPS神経を用いて神経ネットワーク活動をMEAにより記録してAI予測モデルを構築し、神経毒性の高い予測性を有することを明らかにした。また、化学構造に基づくin silico予測とin vitroデータを統合的に活用することにより、in vivo発達神経毒性の予測性向上を示唆する結果が得られた。In vivo実験により、神経炎症や酸化ストレスによる発達神経毒性メカニズムが示唆された。
• 臨床的観点からの成果: 該当なし
• ガイドライン等の開発: OECDのDNT専門家会議に参加して、DNT-IVBガイダンスの改訂に向けて議論を行った。OECDのDNTワークショップにおいて日本におけるDNT-IVBに関する取り組みについての講演を行うとともに、海外規制機関の関係者とのディスカッションと情報収集を行った。また、OECDの拡張一世代生殖発生毒性試験ガイドライン(TG443)の改訂に参画した。
• その他行政的観点からの成果: 該当なし
• その他のインパクト: 該当なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 6件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 10件
• 学会発表(国際学会等): 11件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Ojiro, R., Ozawa, S., Zou, X. et al.; Similar toxicity potential of glyphosate and glyphosate-based herbicide on cerebellar development after maternal exposure in rats.; Environ. Toxicol. , 39 (5) , 3040-3054 (2024)
• 原著論文2: Zou, X., Tang, Q., Ojiro, R. et al.; Increased spontaneous activity and progressive suppression of adult neurogenesis in the hippocampus of rat offspring after maternal exposure to imidacloprid.; Chem. Biol. Interact. , 399 , 111145- (2024)
• 原著論文3: Sakamaki, Y., Shobudani, M., Ojiro, R. et al.; Suppression of hippocampal neurogenesis and oligodendrocyte maturation similar to developmental hypothyroidism by maternal exposure of rats to ammonium perchlorate, a gunpowder raw material and known environmental contaminant.; Env. Toxicol. , 40 (1) , 30-53 (2025)
• 原著論文4: Shobudani, M., Sakamaki, Y., Karasawa, A. et al.; Metabolic shift as a compensatory response to impaired hippocampal neurogenesis after developmental exposure to sodium fluoride in rats.; Acta Histochem. , 126 (8) , 152204- (2024)
• 原著論文5: Mathisen GH, Bearth A, Jones LB et al.; Time for CHANGE: system-level interventions for bringing forward the date of effective use of NAMs in regulatory toxicology.; Arch Toxicol. , 98 (8) , 2299-2308 (2024); doi: 10.1007/s00204-024-03802-6
• 原著論文6: Kojima H.; History of the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines for non-animal test methods in Japan.; Genes Environ. , 47 (1) , 3- (2025); doi: 10.1186/s41021-024-00323-7

公開日・更新日

• 公開日: 2025-06-16
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 202425008Z