遺伝子組換え医薬品等のプリオン除去工程評価の方法に関する研究

文献情報

• 文献番号: 200637026A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 遺伝子組換え医薬品等のプリオン除去工程評価の方法に関する研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H16-食品-一般-019
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 山口 照英(国立医薬品食品衛生研究所 生物薬品部)

研究分担者(所属機関)

• 永田　龍二(国立医薬品食品衛生研究所　遺伝子細胞医薬部)
• 堀内　基広(北海道大学大学院　プリオン病学講座)
• 菊池　裕(国立医薬品食品衛生研究所　衛生微生物部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究費: 10,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細胞培養医薬品等の製造に用いられるウシ等反芻動物由来原材料に混入する危険性のある異常型プリオン(PrP-Sc)に対する安全性確保において、製造工程中のPrP-Sc除去工程の評価は重要である。本研究では、PrP-Sc除去工程に関する総合的なリスク評価を行い、科学的見地から安全性を確保するための合理的方策を提示することを目的とする。

研究方法

(1)プリオン蛋白質(PrP)のC末端とGPIアンカーシグナル配列を欠損したスプライス変異型ヒトPrPを大腸菌で発現させた。
(2)スクレイピー263K株感染ハムスター脳由来ミクロソーム画分をサルコシル3％で抽出した画分をPBS又は人免疫グロブリン5％に添加し、孔径35又は20 nmのろ過膜で加圧ろ過した。
(3)学術論文等の公表資料を対象に調査研究を行った。

結果と考察

(1)継代数を重ねたT98G細胞がスプライス変異型GPIアンカー欠損PrPを発現し、その産生は低酸素濃度下で誘導されることを見いだした。当該蛋白質は非イオン性界面活性剤に易溶性で、細胞質画分に分布していた。
(2)3.0％サルコシル抽出ミクロソーム画分をPBS又は免疫グロブリン溶液の溶媒である0.3 mol/Lグリシン溶液に添加した病原体溶液を使用した場合、クリアランス指数（RF）は1以上であったが、PrP-Scは孔径35 nmの膜を通過した。しかし、同20 nmの膜のろ液中にはPrP-Scが検出されなかった。一方、5％人免疫グロブリン溶液を含む病原体溶液を使用した場合、PrP-Scは同35 nmの膜のろ液中には検出されなかった。以上より、PrP-Sc凝集体の中には、排除サイズ35 nmの多孔性膜を通過し得るサイズのものが存在すること、その除去効率は溶液の性状により変化することが明らかとなった。
(3)欧州ではプリオン除去フィルターが昨年承認され、英国及びアイルランドの血液センターで実用化のための評価試験が実施中である。今年に入ってからは、トランスジェニック技術によりプリオン遺伝子をもたないウシの作製に成功したとの報告もあり、医薬品等のPrP-Sc安全性を確保する新しい方策の候補として、これら新技術の開発動向には十分注意しておく必要がある。

結論

医薬品等製造工程のPrP-Scクリアランス評価や除去工程に関する新規の知見や有用な結果が得られた。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-03-29
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200637026B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 遺伝子組換え医薬品等のプリオン除去工程評価の方法に関する研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H16-食品-一般-019
• 研究年度: 平成18(2006)年度
• 研究代表者(所属機関): 山口 照英(国立医薬品食品衛生研究所 生物薬品部)

研究分担者(所属機関)

• 永田　龍二(国立医薬品食品衛生研究所　遺伝子細胞医薬部)
• 堀内　基広(北海道大学大学院　プリオン病学講座)
• 菊池　裕(国立医薬品食品衛生研究所　衛生微生物部)
• 内田　恵理子(国立医薬品食品衛生研究所　遺伝子細胞医薬部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成16(2004)年度
• 研究終了予定年度: 平成18(2006)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

細胞培養医薬品等の製造に用いられるウシ等反芻動物由来原材料に混入する危険性のある異常型プリオン(PrP-Sc)に対する安全性確保において、製造工程中のPrP-Sc除去工程の評価は重要である。本研究では、PrP-Sc除去工程に関する総合的なリスク評価を行い、科学的見地から安全性を確保するための合理的方策を提示することを目的とする。

研究方法

(1)ヒトT98G細胞株の産生するスプライス変異型プリオン蛋白質(GPIˉ PrPSV)を見出し、その性質等を検討した。また、大腸菌で組換え蛋白質及びモノクローナル抗体も作製した。
(2)スクレイピー263K株感染ハムスター脳由来ミクロソーム画分(MF)をサルコシル3％で抽出した画分の、プリオンクリアランス試験における有用性について実験的に評価した。
(3)学術論文等の公表資料を対象に調査研究を行った。

結果と考察

(1)ヒトT98G細胞株がGPIˉ PrPSVを産生することを見出し、ヒト組換えPrP及びGPIˉ PrPSVのコドン129 Met/Valそれぞれの組換え蛋白質及びGPIˉ PrPSVを特異的に認識するモノクローナル抗体HPSV178を樹立した。
(2)MFからサルコシル3％で抽出したPrP-Sc画分をクリアランス評価のスパイク用試料とする有用性を検証した結果、粒子サイズが小さく、より厳格な評価ができることを確認した。また、除去効率は溶液の性状により変化することを明らかにした。
(3)細胞培養技術応用医薬品や現在流通している各種血漿分画製剤等について、生物由来原料基準に適合するウシ等反芻動物由来原材料を用いているかぎりにおいては一定のPrP-Sc安全性が確保されていると判断されることを確認した。しかしながら、類似の製造工程でも個々のクリアランス能には大きな開きがあり、製造時の種々のパラメータの違いが実際のクリアランス能に大きく影響し得ることを文献的に明らかにした。
(4)血漿分画製剤製造でのPrP-Scクリアランス評価のための欧州の指針に基づきながら、細胞培養技術応用医薬品等の製造工程におけるPrP-Sc除去／不活化能の評価を行う際の要点を明らかにした。

結論

医薬品等製造工程のPrP-Scクリアランス評価や除去工程に関する新規の知見や有用な結果が得られた。

公開日・更新日

• 公開日: 2007-03-29
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200637026C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究成果に関連して学術雑誌や学会等での発表もすでに行っている。いずれも新規の知見が得られており、学術的にも興味深い成果であるとともに、バイオ医薬品等のプリオン安全性評価を実施し、医薬品の品質を確保する上でも実用性の高い、いわば再生医療やワクチンも含めたバイオ医薬品等のトランスレーショナルリサーチや開発・実用化を側面からサポートできる総合的な成果である。
• 臨床的観点からの成果: 本研究成果は直接的に臨床に結び付くものではないが、血液製剤等も含めたバイオ医薬品の品質の確保、すなわち臨床的有効性の恒常性を保ちつつ、異常型プリオンという感染性因子に関する臨床的安全性をより向上させるという点では、臨床にも十分寄与するものである。
• ガイドライン等の開発: これらの研究成果は、医薬品等の製造工程におけるプリオンクリアランス評価に関してわが国及び国際的なガイドラインがない現状においては、規制当局のみならず、医薬品等の製造／輸入販売業者にとっても、自社の製品についてのプリオン安全性を評価する上で有用な情報となり得ることから、厚生労働省関連部局にこれらの成果を適宜連絡し、情報を共有している。国際的なガイドラインが将来策定されることになれば、わが国からも本研究成果に基づき大きな寄与ができると期待される。
• その他行政的観点からの成果: －
• その他のインパクト: －

発表件数

• 原著論文（和文）: 2件
• 原著論文（英文等）: 15件
• その他論文(和文): 5件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 13件
• 学会発表(国際学会等): 12件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yamaguchi, S., Nishida, Y., Sasaki, K., et al.; Inhibition of PrP-Sc formation by synthetic O-sulfated glycopyranosides and their polymers; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 349 , 485-491 (2006)
• 原著論文2: Watanabe, Y., Inanami, O., Horiuchi, M., et al.; Identification of pH-sensitive regions in the mouse prion by the cysteine-scanning spin-labeling ESR technique; Biochem. Biophys.Res. Commun. , 350 , 549-556 (2006)
• 原著論文3: Horiuchi, M., Furuoka, H., Kitamura, N., et al.; Alymphoplasia mice are resistant to prion infection via oral route; Jpn. J. Vet. Res. , 53 , 150-159 (2006)
• 原著論文4: Nakamitsu, S., Miyazawa, T., Horiuchi, M., et al; Sequence variation of bovine prion protein gene in Japanese cattle (Holstein and Japanese Black); J. Vet. Med. Sci. , 68 , 27-33 (2006)
• 原著論文5: 山口 照英; 医薬品各条の改正点－生物薬品; 薬局 , 57 , 89-95 (2006)
• 原著論文6: Furuoka, H., Yabuzoe, A., Horiuchi, M., et al.; Effective antigen-retrieval method for immunohistochemical detection of abnormal isoform of prion proteins in animals; Acta Neuropathol. , 109 , 263-271 (2005)
• 原著論文7: Inanami, O., Hashida, S., Iizuka, D., et al.; Conformational change in full-length mouse prion: A site-directed spin-labeling study; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 335 , 785-792 (2005)
• 原著論文8: Iwata, A., Yamaguchi, T., Sato, K., et al.; Suppression of proliferation of poliovirus and porcine parvovirus by novel phenoxazines, 2-amino-4,4α-dihydro-4α-7-dimethyl-3H-phenoxazine-3-one and 3-amino-1,4α-dihydro-4α-8-dimethyl-2H-phenoxazine-2-one; Biol. Pharm. Bull. , 28 , 905-907 (2005)
• 原著論文9: Yamamoto, Y., Akita, Y., Tai, S., et al.; Two-dimensional electrophoretic analysis of disease-associated proteins in human cerebrospinal fluid from patients with rheumatoid arthritis; J. Electrophoresis , 49 , 23-27 (2005)
• 原著論文10: Kurosaki, Y., Ishiguro, N., Horiuchi, M., et al.; Polymorphisms of caprine PrP gene detected in Japan; J. Vet. Med. Sci. , 67 , 321-323 (2005)
• 原著論文11: Kataoka, N., Nishimura, M., Horiuchi, M., et al.; Surveillance of chronic wasting disease in sika deer, Cervus nippon, from Tokachi district in Hokkaido; J. Vet. Med. Sci. , 67 , 349-351 (2005)
• 原著論文12: 水沢 左衛子, 岡田 義昭, 堀内 善信, 他; C型肝炎ウイルスRNAの遺伝子検査法のための第一次国内標準品の作製; 日本輸血学会雑誌 , 51 , 515-519 (2005)
• 原著論文13: Kikuchi, Y., Kakeya, T., Sakai, A., et al.; Propagation of a protease-resistant form of prion protein in long-term cultured human glioblastoma cell line T98G; J. Gen. Virol. , 85 , 3449-3457 (2004)
• 原著論文14: Kim, C-L., Karino, A., Ishiguro, N., et al.; Cell-surface retention of PrP-c by anti-PrP antibody prevents protease-resistant PrP formation; J. Gen. Virol. , 85 , 3473-3482 (2004)
• 原著論文15: Gombojav, A., Ishiguro, N., Horiuchi, M., et al.; Unique amino acid polymorphisms of PrP genes in Mongolian sheep breeds; J. Vet. Med. Sci. , 66 , 1293-1295 (2004)
• 原著論文16: Kim, C-L., Umetani, A., Matsui, T., et al.; Antigenic characterization of an abnormal isoform of prion protein using a new diverse panel of monoclonal antibodies; Virology , 320 , 40-51 (2004)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-30
• 更新日: -