早期膵臓がん検出マーカーの同定

文献情報

• 文献番号: 200500483A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 早期膵臓がん検出マーカーの同定
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H16-３次がん-019
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 山下 義博(自治医科大学医学部 ゲノム機能研究部)

研究分担者(所属機関)

• 間野　博行(自治医科大学医学部　ゲノム機能研究部)
• 菅野　健太郎(自治医科大学医学部　消化器内科学講座)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第3次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成15(2003)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究費: 13,500,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

膵臓がんは極めて予後不良な悪性腫瘍であり、特徴的臨床所見に乏しく、診断が確定した時点では既にがんが進行し根治手術が困難な例がほとんどを占める。しかも診断目的で施行する膵液細胞診による膵臓がんの診断率も依然高くなく新たな診断マーカーの同定が世界的な急務といえる。本研究計画において我々は、膵管上皮細胞を用いたDNAチップ解析を大規模に行うことにより、膵がん細胞特異的発現を示す遺伝子の同定を行う。

研究方法

（1）検体の純化。上皮細胞特異的表面蛋白MUC1に対する抗体を用いたマグネティックビーズカラムによるMUC1陽性細胞の簡便な純化装置を開発した。また本邦に広く分布する研究協力施設において、周辺病院より採取した膵液から膵管上皮細胞を効率よく純化保存する事業を開始した。（2）膵臓がん4症例と正常4症例の膵管上皮細胞よりmRNAを抽出したのちそれぞれ混合したmRＮAプールを作り、両者の間でcDNAサブトラクション実験を行い、膵臓がん特異的なcDNAの同定を試みた。

結果と考察

（1）膵臓がん4例および健常者4例のサンプルからcDNA調整しそれぞれプールした後、両グループ間で発現が異なるcDNA断片のサブトラクションクローニングを行った。同定された384×２＝768クローンのcDNAについてone-pass seqeunceを行い、そのannotationも終了した。これら膵癌特異的遺伝子の候補cDNAについて、検体約２０例を用いた一次スクリーニングパネルによる定量的リアルタイムPCR実験を行った。その結果１０種類以上の膵臓がんマーカーの候補が同定された。さらに症例数を増加した二次スクリーニングパネルの検体を用いた発現定量を行い、最終的に複数の新規膵臓がんマーカー遺伝子を同定することに成功した。中でも遺伝子Aの発現量は、正常膵臓30例において0.55 U ± 1.79（平均±標準偏差）、良性膵腫瘍19例において32.4 U ± 70.1、膵臓がん39例において54.6 U ± 142.7と明瞭な腫瘍特異性を示した。

結論

膵管上皮細胞のバンク事業はその後も拡充に努めており、さらにこれら試料を用いたcDNAサブトラクション法による膵臓がん特異的遺伝子のスクリーニングと、DNAマイクロアレイによる膵臓がん細胞の遺伝子発現プロファイル解析も継続している。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-04-07
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200500483B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 早期膵臓がん検出マーカーの同定
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H16-３次がん-019
• 研究年度: 平成17(2005)年度
• 研究代表者(所属機関): 山下 義博(自治医科大学医学部 ゲノム機能研究部)

研究分担者(所属機関)

• 間野　博行(自治医科大学医学部　ゲノム機能研究部)
• 菅野　健太郎(自治医科大学医学部　消化器内科学講座)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第3次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成15(2003)年度
• 研究終了予定年度: 平成17(2005)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

膵臓がんは極めて予後不良な悪性腫瘍であり、特徴的臨床所見に乏しく、診断が確定した時点では既にがんが進行し根治手術が困難な例がほとんどを占める。しかも診断目的で施行する膵液細胞診による膵臓がんの診断率も依然高くなく新たな診断マーカーの同定が世界的な急務といえる。本研究計画において我々は、大規模な膵管上皮細胞検体収集事業を行い、DNAチップ解析あるいはサブトラクションcDNAクローニング実験を行うことにより、膵がん細胞特異的発現を示す遺伝子の同定を行う。

研究方法

（1）検体の純化。上皮細胞特異的表面蛋白MUC1に対する抗体を用いたマグネティックビーズカラムによるMUC1陽性細胞の簡便な純化装置を開発した。また本邦に広く分布する研究協力施設において、周辺病院より採取した膵液から膵管上皮細胞を効率よく純化保存する事業を開始した。（2）健常人25例および膵がん患者24例、計49例の膵管上皮よりmRNAを抽出し、DNAチップによる網羅的遺伝子発現解析を行った。（3）膵臓がん4症例と正常4症例の膵管上皮細胞よりmRNAを抽出したのちそれぞれ混合したmRＮAプールを作り、両者の間でcDNAサブトラクション実験を行い、膵臓がん特異的なcDNAの同定を試みた。

結果と考察

（1）平成１8年３月現在で健常人47例、慢性膵炎54例、良性膵腫瘍56例、膵臓がん95例、その他78例の計330例の純化検体細胞の保存に成功した。（2）DNAチップによる発現データから膵臓がんの有無で発現量が有意に異なる遺伝子をWelch’s ANOVAテスト（P<0.001）およびeffect size >50 Uでスクリーニングしたところ、21プローブセット（20遺伝子に相当）が同定された。得られた遺伝子の発現量をもとに疾患を判定するアルゴリズムの開発に成功した。（3）cDNA断片のサブトラクションクローニングにより10種類以上の膵臓がんマーカーの候補を同定した。中でも遺伝子Aの発現量は、正常膵臓30例において0.55 U ± 1.79（平均±標準偏差）、良性膵腫瘍19例において32.4 U ± 70.1、膵臓がん39例において54.6 U ± 142.7と明瞭な腫瘍特異性を示した。

結論

膵管上皮細胞のバンク事業はその後も拡充に努めており、さらにこれら試料を用いたcDNAサブトラクション法による膵臓がん特異的遺伝子のスクリーニングと、DNAマイクロアレイによる膵臓がん細胞の遺伝子発現プロファイル解析も継続している。

公開日・更新日

• 公開日: 2006-04-07
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200500483C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究を通して膵管上皮細胞の検体収集事業が行われ、計３３０例に及ぶ検体の保存が行われた。現在このような膵管上皮細胞のストックは他に存在せず、今後の膵臓がんの細胞解析の上で貴重なリソースが形成された。また膵管上皮細胞を試料としたDNAマイクロアレイ解析及びcDNAサブトラクションクローニングなど膵臓がんの新規分子診断マーカー開発に重要な基礎実験が行われた。
• 臨床的観点からの成果: DNAマイクロアレイを用いた、膵管上皮細胞内の遺伝子発現量に基づく膵臓がん診断法の開発研究については、８０％以上の正答率を得ることが可能であった。このことは遺伝子発現量を用いて膵臓がんが診断できうることを示唆しており、膵臓がんの臨床に新しい可能性を示したと言える。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 89件
• その他論文(和文): 34件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 26件
• 学会発表(国際学会等): 20件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Koinuma K, Yamashita Y, Liu W, et al.; Epigenetic silencing of AXIN2 in colorectal carcinoma with microsatellite instability; Oncogene , 25 , 139-146 (2006)
• 原著論文2: Kisanuki H, Choi YL, Wada T, et al.; Retroviral expression screening of oncogenes in pancreatic ductal carcinoma; Eur. J. Cancer , 41 , 2170-2175 (2005)
• 原著論文3: Ishikawa M, Yoshida K, Yamashita Y, et al.; Experimental trial for diagnosis of pancreatic ductal carcinoma based on gene expression profiles of pancreatic ductal cells; Cancer Sci. , 96 , 387-393 (2005)
• 原著論文4: Koinuma K, Kaneda R, Toyota M, et al.; Screening for genomic fragments that are methylated specifically in colorectal carcinoma with a methylated MLH1 promoter; Carcinogenesis , 26 , 2078-2085 (2005)
• 原著論文5: Fujiwara S, Yamashita Y, Choi YL, et al.; Transforming activity of the lymphotoxin-beta receptor revealed by expression screening; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 338 , 1256-1262 (2005)
• 原著論文6: Choi YL, Moriuchi R, Osawa M, et al.; Retroviral expression screening of oncogenes in natural killer cell leukemia; Leuk. Res. , 29 , 943-949 (2005)
• 原著論文7: Tsutsumi C, Ueda M, Miyazaki Y, et al.; DNA microarray analysis of dysplastic morphology associated with acute myeloid leukemia; Exp. Hematol. , 32 , 828-835 (2005)
• 原著論文8: Numata A, Shimoda K, Kamezaki K, et al.; Signal transducers and activators of transcription 3 augments the transcriptional activity of CCAAT/enhancer-binding protein alpha in granulocyte colony-stimulating factor signaling pathway; J. Biol. Chem. , 280 , 12621-12629 (2005)
• 原著論文9: Kaneda R, Ueno S, Yamashita Y, et al.; Genome-wide screening for target regions of histone deacetylases in cardiomyocytes; Circ. Res. , 97 , 210-218 (2005)
• 原著論文10: Koinuma K, Shitoh K, Miyakura Y, et al.; Mutations of BRAF are associated with extensive hMLH1 promoter methylation in sporadic colorectal carcinomas; Int. J. Cancer , 108 , 237-242 (2004)
• 原著論文11: Bai J, Sata N, Nagai H, et al.; Genistein-Induced Changes in Gene Expression in Panc 1 Cells at Physiological Concentrations of Genistein; Pancreas , 29 , 93-98 (2004)
• 原著論文12: He H, Hirokawa Y, Gazit A, et al.; The Tyr-kinase inhibitor AG879, that blocks the ETK-PAK1 interaction, suppresses the RAS-induced PAK1 activation and malignant transformation; Cancer Biol. Ther. , 3 , 96-101 (2004)
• 原著論文13: Kaneda R, Toyota M, Yamashita Y, et al.; High-throughput screening of genome fragments bound to differentially acetylated histones; Genes Cells , 9 , 1167-1174 (2004)
• 原著論文14: Yoshida K, Ueno S, Iwao T, et al.; Screening of genes specifically activated in the pancreatic juice ductal cells from the patients with pancreatic ductal carcinoma; Cancer Sci. , 94 , 263-270 (2003)
• 原著論文15: Suzuki N, Nakamura S, Mano H, et al.; Galpha 12 activates Rho GTPase through tyrosine-phosphorylated leukemia-associated RhoGEF; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A , 100 , 733-738 (2003)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-10-06
• 更新日: -