化学物質の有害性評価の迅速化・高度化・標準化に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201926001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 化学物質の有害性評価の迅速化・高度化・標準化に関する研究
• 課題番号: H29-化学-一般-001
• 研究年度: 令和1(2019)年度
• 研究代表者(所属機関): 鰐渕 英機(大阪市立大学 大学院医学研究科)

研究分担者(所属機関)

• 塚本　徹哉(藤田医科大学　医学部)
• 魏　民(大阪市立大学　大学院医学研究科)
• 横平　政直(香川大学　医学部)
• 豊田　武士(国立医薬品食品衛生研究所　病理部)
• 鈴木　周五(大阪市立大学　大学院医学研究科)
• 戸塚　ゆ加里(国立がん研究センター研究所　発がん・予防研究分野)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成29(2017)年度
• 研究終了予定年度: 令和1(2019)年度
• 研究費: 18,740,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

生活環境を取り巻く化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に検証できるシステムの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要であり、システムで得られた結果は国民生活の安全･安心を保証する重要な基盤となる。本研究では化学物質の発がん性評価の迅速化・高精度化・標準化を目的に、これまでの研究で蓄積してきたで病理組織発がんマーカー及び試験法をより一層発展・高精度化し、高精度発がん評価モデルとして確立する。さらに国際的に認知させる必要があるため、それらの発がん性評価法のOECDテストガイドライン化を目指すことが重要である。そこで、本申請研究においては、OECDテストガイドライン化の成立を最終目的として、6研究施設による協同体制にて下記に記す三つの研究を実施する。第一に、膀胱を標的とする発がん物質を用いた28日間反復投与試験を実施し、病理組織発がんマーカーを用いた膀胱発がんリスク評価法を確立する。第二に、これまで開発した遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルの有用性をより一層検証し、確立する。第三に、上記の試料を用いてDNA付加体を網羅的に解析しカタログ化する方法（アダクトーム解析）による化学物質のDNA損傷を指標とした遺伝毒性評価法を開発する。

研究方法

γ-H2AXを用いた短期膀胱発がんリスク評価法では、膀胱発がん物質2種、非膀胱発がん物質8種について、ラットを用いた28日間反復経口投与試験を実施し、膀胱粘膜上皮におけるγ-H2AX形成を免疫組織化学的に検討した。また、用量相関性の検討として、遺伝毒性膀胱発がん物質N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamineまたは非遺伝毒性膀胱発がん物質メラミンについて複数用量による検討を行った。遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルの有用性の検証では、前年度までに偽陰性となった6種の遺伝毒性肝発がん物質について、投与用量を上げてラット単回投与を行い、投与24時間後の肝臓におけるマーカー遺伝子（10遺伝子）の発現データをqPCRで取得し、我々が構築した遺伝毒性肝発がん物質検出モデルを用いて肝発がん性を予測した。また、肝臓からDNAを抽出・消化後にLC-TOF MS に供しDNA付加体の網羅的解析を行った。得られたデータをPCA解析により分類した。遺伝毒性や肝発がん性を付加体から予測するモデルを、教師あり機械学習手法を用いて試作した。

結果と考察

膀胱粘膜上皮におけるγ-H2AX形成を免疫組織化学的に検討した結果、膀胱発がん物質2物質中1物質で有意に増加した。また、膀胱を標的としない物質8種類は対照群と同程度で、本検出モデルの特異性を確認出来た。これまでに蓄積された65物質のデータを総合すると、γ-H2AX免疫染色によって化学物質のラット膀胱に対する発がん性を、感度82.9%（29/35）及び特異度100%（30/30）と、高い精度で予測できることが示された。また、遺伝毒性及び非遺伝毒性膀胱発がん物質2種を用いて、γ-H2AX形成が明瞭な用量相関性を示すことを確認した。遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルを用いて検討した結果、偽陰性となった6物質のうち2物質が陽性となった。これまでに取得した60物質のデータを総合すると、感度82.6%(19/23)及び特異度97.3%(36/37)と、高い精度で検出できる可能性が示唆された。さらに、遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルで用いた29物質の肝組織を用いたDNAアダクトーム解析による評価を行った結果、主成分分析により遺伝毒性及び肝発がん物質の分類が明瞭に出来た。また、毒性予測モデルを作成し検討した結果、遺伝毒性については感度100%(11/11)及び特異度88.9%(16/18)、肝発がん性については感度90.0%(9/10)及び特異度100%(19/19)と高い予測性を示した。

結論

γ-H2AXを用いた短期膀胱発がんリスク評価法では、感度82.9%（29/35）及び特異度100%（30/30）と、遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルでは、感度82.6%(19/23)及び特異度97.3%(36/37)と、いずれも高い精度で検出できる可能性が示唆された。また、DNAアダクトーム解析による評価でも高い精度を認め、新しい評価法としての可能性を示した。また、「膀胱におけるγ-H2AX免疫染色」を、28日間反復経口投与毒性試験に対する既存のOECDテストガイドライン（TG407）に、オプションとして追加する改定案に対するOECD加盟国・機関からの指摘に対して、対応した。

公開日・更新日

• 公開日: 2020-12-14
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201926001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 化学物質の有害性評価の迅速化・高度化・標準化に関する研究
• 課題番号: H29-化学-一般-001
• 研究年度: 令和1(2019)年度
• 研究代表者(所属機関): 鰐渕 英機(大阪市立大学 大学院医学研究科)

研究分担者(所属機関)

• 塚本　徹哉(藤田医科大学　医学部)
• 魏　民(大阪市立大学　大学院医学研究科)
• 横平　政直(香川大学　医学部)
• 豊田　武士(国立医薬品食品衛生研究所　病理部)
• 鈴木　周五(大阪市立大学　大学院医学研究科)
• 戸塚　ゆ加里(国立がん研究センター研究所　発がん・予防研究分野)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成29(2017)年度
• 研究終了予定年度: 令和1(2019)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

生活環境を取り巻く化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に検証できるシステムの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要であり、システムで得られた結果は国民生活の安全･安心を保証する重要な基盤となる。本研究では化学物質の発がん性評価の迅速化・高精度化・標準化を目的に、これまでの研究で蓄積してきた病理組織発がんマーカー及び試験法をより一層発展・高精度化し、高精度発がん評価モデルとして確立する。さらに国際的に認知させる必要があるため、それらの発がん性評価法のOECDテストガイドライン化を目指すことが重要である。そこで、本申請研究においては、OECDテストガイドライン化の成立を最終目的として、6研究施設による協同体制にて下記に記す三つの研究を実施する。第一に、膀胱を標的とする発がん物質を用いた28日間反復投与試験を実施し、病理組織発がんマーカーを用いた膀胱発がんリスク評価法を確立する。第二に、これまで開発した遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルの有用性をより一層検証し、確立する。第三に、上記の試料を用いてDNA付加体を網羅的に解析しカタログ化する方法（アダクトーム解析）による化学物質のDNA損傷を指標とした遺伝毒性評価法を開発する。

研究方法

γ-H2AXを用いた短期膀胱発がんリスク評価法では、膀胱発がん物質35種、非膀胱発がん物質30種について、ラットを用いた28日間反復経口投与試験を実施し、膀胱粘膜上皮におけるγ-H2AX形成を免疫組織化学的に検討した。遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルの有用性の検証では、遺伝毒性肝発がん物質23種及び37種類のそれ以外の化合物（非遺伝毒性肝発がん物質、肝以外の発がん物質、非発がん物質）について、ラット単回投与を行い、投与24時間後の肝臓におけるマーカー遺伝子（10遺伝子）の発現データをqPCRで取得し、我々が構築した遺伝毒性肝発がん物質検出モデルを用いて肝発がん性を予測した。また、肝臓からDNAを抽出・消化後にLC-TOF MS に供しDNA付加体の網羅的解析を行った。得られたデータをPCA解析により分類した。遺伝毒性や肝発がん性を付加体から予測するモデルを、教師あり機械学習手法を用いて試作した。

結果と考察

膀胱粘膜上皮におけるγ-H2AX形成を免疫組織化学的に検討した結果、膀胱発がん物質35物質中29物質で有意に増加した。一方で、非膀胱発がん物質30物質ではいずれも対照群と有意な差は認められなかった。γ-H2AX免疫染色によって化学物質のラット膀胱に対する発がん性を、感度82.9%（29/35）及び特異度100%（30/30）と、高い精度で予測できることが示された。遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルを用いて検討した結果、遺伝毒性肝発がん物質23種を含む60物質について、感度82.6%(19/23)及び特異度97.3%(36/37)と、高い精度で検出できる可能性が示唆された。さらに、遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルで用いた29物質の肝組織を用いたDNAアダクトーム解析による評価を行った結果、主成分分析により遺伝毒性及び肝発がん物質の分類が明瞭に出来た。また、毒性予測モデルを作成し検討した結果、遺伝毒性については感度100%(11/11)及び特異度88.9%(16/18)、肝発がん性については感度90.0%(9/10)及び特異度100%(19/19)と高い予測性を示した。

結論

γ-H2AXを用いた短期膀胱発がんリスク評価法では、感度82.9%（29/35）及び特異度100%（30/30）と、遺伝毒性肝発がん物質短期検出モデルでは、感度82.6%(19/23)及び特異度97.3%(36/37)と、いずれも高い精度で検出できる可能性が示唆された。また、DNAアダクトーム解析による評価でも高い精度を認め、新しい評価法としての可能性を示した。また、「膀胱におけるγ-H2AX免疫染色」を、28日間反復経口投与毒性試験に対する既存のOECDテストガイドライン（TG407）に、オプションとして追加する改定案を提出し、OECD加盟国・機関からの指摘に対応した。

公開日・更新日

• 公開日: 2020-12-14
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201926001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究は、γ-H2AXをマーカーとした中期膀胱発がん性評価法を確立した。また、遺伝毒性肝発がん物質を高い精度で検出できる遺伝子セットを用いた短期肝発がん性予測モデルを開発した。さらに、DNAアダクトーム解析によるDNA損傷を指標とした化学物質の肝発がん性・遺伝毒性への分類を検討し、遺伝毒性および肝発がん性の予測が可能であることを示した。これらの成果を元に化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に検証できるシステムが確立できると考えられる。
• 臨床的観点からの成果: なし
• ガイドライン等の開発: 「膀胱におけるγ-H2AX免疫染色による発がん性評価法」を、既存のOECDテストガイドライン（TG407：28日間反復経口投与毒性試験）に、オプションとして追加する改定案を提出したが、OECDのナショナル・コーディネーター作業部会で標的臓器が膀胱のみでは、ガイドライン化が困難であると指摘された。現在、OECDのIntegrated Approaches to Testing and Assessment(IATA)として提案する準備をしている。
• その他行政的観点からの成果: 生活環境を取り巻く化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に検証できるシステムの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要である。本研究で開発した発がん性評価法およびガイドラインは、そのシステム確立に貢献できる成果であり、厚生労働行政施策の科学的基盤となり得る。また、得られた発がん性に関する情報は厚生労働行政施策への活用が期待できる。以上より、本研究は国民を取り巻く生活環境における化学物質の発がん性評価と国のがん予防施策に貢献し、社会へ還元できると研究である。
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 53件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 71件
• 学会発表(国際学会等): 7件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Matsue T, Gi M, Wanibuchi H. et al.; The carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide inhibits urinary bladder cancers via suppression of beta-catenin signaling.; Cancer Sci , 113 , 2642-2653 (2022)
• 原著論文2: Kakehashi A, Chariyakornkul A, Wanibuchi H. et al.; Cache Domain Containing 1 Is a Novel Marker of Non-Alcoholic Steatohepatitis-Associated Hepatocarcinogenesis.; Cancers (Basel) , 13 , 1216-1216 (2021)
• 原著論文3: Kakehashi A, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Canopy Homolog 2 as a Novel Molecular Target in Hepatocarcinogenesis. ; Cancers (Basel) , 13 , 3613- (2021)
• 原著論文4: Suzuki S, Gi M, Wanibuchi H. et al.; Role of gamma-H2AX as a biomarker for detection of bladder carcinogens in F344 rats.; J Toxicol Pathol , 33 , 279-285 (2020)
• 原著論文5: Suzuki S, Cohen SM, Wanibuchi H. et al.; Cell proliferation of rat bladder urothelium induced by nicotine is suppressed by the NADPH oxidase inhibitor, apocynin.; Toxicol Lett , 33 , 279-285 (2020)
• 原著論文6: Totsuka Y, Maesako Y, Wanibuchi H. et al.; Comprehensive analysis of DNA adducts (DNA adductome analysis) in the liver of rats treated with 1,4-dioxane.; Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci , 96 , 180-187 (2020)
• 原著論文7: Fujioka M, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Dimethylarsinic acid (DMA) enhanced lung carcinogenesis via histone H3K9 modification in a transplacental mouse model.; Arch Toxicol , 94 , 927-937 (2020)
• 原著論文8: Yamada T, Toyoda T, Ogawa K. et al.; Dose dependency of γ-H2AX formation in the rat urinary bladder treated with genotoxic and nongenotoxic bladder carcinogens.; J Appl Toxicol , 40 , 1219-1227 (2020)
• 原著論文9: Gi M, Fujioka M, Wanibuchi H. et al.; Quantitative analysis of mutagenicity and carcinogenicity of 2-amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline in F344 gpt delta transgenic rats.; Mutagenesis , 34 , 279-287 (2019)
• 原著論文10: Okuno T, Gi M, Wanibuchi H. et al.; Acetoaceto-o-Toluidide Enhances Cellular Proliferative Activity in the Urinary Bladder of Rats. ; Toxicol Sci , 169 , 456-464 (2019)
• 原著論文11: Okabe A, Kiriyama Y, Suzuki S. et al.; Short-term detection of gastric genotoxicity using the DNA double-strand break marker gamma-H2AX. ; J Toxicol Pathol , 32 , 91-99 (2019)
• 原著論文12: Toyoda T, Matsushita K, Ogawa K. et al.; Distinct differences in the mechanisms of mucosal damage and γ-H2AX formation in the rat urinary bladder treated with o-toluidine and o-anisidine.; Arch Toxicol , 93 , 753-762 (2019)
• 原著論文13: Sone M, Toyoda T, Ogawa K. et al.; Immunohistochemistry of γ-H2AX as a method of early detection of urinary bladder carcinogenicity in mice. ; J Appl Toxicol , 39 , 868-876 (2019)
• 原著論文14: Gi M, Fujioka M, Wanibuchi H. et al.; Chronic dietary toxicity and carcinogenicity studies of dammar resin in F344 rats. ; Arch Toxicol , 92 , 3565-3583 (2018)
• 原著論文15: Gi M, Fujioka M, Wanibuchi H. et al.; In vivo positive mutagenicity of 1,4-dioxane and quantitative analysis of its mutagenicity and carcinogenicity in rats. ; Arch Toxicol , 92 , 3207-3221 (2018)
• 原著論文16: Suzuki S, Kato H, Takahashi S. et al.; Early detection of prostate carcinogens by immunohistochemistry of HMGB2. ; J Toxicol Sci , 43 , 359-367 (2018)
• 原著論文17: Toyoda T, Totsuka Y, Ogawa K. et al.; γ-H2AX formation in the urinary bladder of rats treated with two norharman derivatives obtained from o-toluidine and aniline. ; J Appl Toxicol , 38 , 534-543 (2018)
• 原著論文18: Yokohira M, Yamakawa K, Imaida K. et al.; Characteristics of surfactant proteins in tumorigenic and inflammatory lung lesions in rodents. ; J. Toxicol. Pathol. , 31 (4) , 231-240 (2018)
• 原著論文19: Tachibana H, Gi M, Wanibuchi H. et al.; Carbonic anhydrase 2 is a novel invasion-associated factor in urinary bladder cancers.; Cancer Sci , 108 , 331-337 (2017)
• 原著論文20: Yokohira M, Nakano-Narusawa Y, Imaida K. et al.; Validating the use of napsin A as a marker for identifying tumorigenic potential of lung bronchiolo-alveolar hyperplasia in rodents. ; Exp. Toxicol. Pathol. , 69 (8) , 637-642 (2017)

公開日・更新日

• 公開日: 2022-06-06
• 更新日: 2023-07-28

収支報告書

• 文献番号: 201926001Z
• 報告年月日: 2020年09月30日

収入

• (1)補助金交付額: 23,000,000円
• (2)補助金確定額: 22,623,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 377,000円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	14,407,795円
		人件費・謝金	1,015,074円
		旅費	1,009,499円
		その他	1,931,413円
	間接経費		4,260,000円
	合計		22,623,781円

備考

備考

研究分担者豊田武士に残額が発生したため、自己資金で781円を支出し、377,000円を返納した。

公開日・更新日

• 公開日: 2020-11-25
• 更新日: -