文献情報
文献番号
201435004A
報告書区分
総括
研究課題名
手術中に膵液の漏出部位を同定し蛋白分解酵素活性を評価する蛍光イメージング技術の開発
課題番号
-
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
石沢 武彰(東京大学医学部附属病院 肝胆膵・人工臓器移植外科)
研究分担者(所属機関)
- 國土 典宏(東京大学医学部附属病院 肝胆膵・人工臓器移植外科)
- 山本 訓史(東京大学医学部附属病院 肝胆膵・人工臓器移植外科)
- 浦野 泰照(東京大学大学院 医学系研究科 生体情報学講座)
- 神谷 真子(東京大学大学院 医学系研究科 生体情報学講座)
- 斎浦 明夫(がん研有明病院 消化器外科 肝胆膵外科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【委託費】 医療技術実用化総合研究（臨床研究・治験推進研究事業）
研究開始年度
平成26(2014)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
46,200,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
蛋白分解酵素活性に基づいて膵液を蛍光標識する術中イメージング技術を開発するにあたり、glutaryl-phenylalanine hydroxymethyl rhodamine green (gPhe-HMRG)と反応生成物たるHMRGの非臨床安全性試験を実施すること。同時に、試薬合成の体制と手術室における撮像環境を整備し、治験計画の骨子を策定すること。
研究方法
I. キモトリプシンプローブ最適化に関する検討
ブタ体腔内で膵実質を自動縫合器で離断。キモトリプシンプローブ（gPhe-HMRG 50μMにtrypsin 400μg/mL添加） 200μLを散布。実験用蛍光イメージャーで観察した。
II. gPhe-HMRG, HMRGの非臨床安全性試験の実施
PMDA薬事戦略相談対面助言を受けて決定した非臨床安全性試験のうち、単回投与毒性試験、遺伝毒性試験、hERG電流に対する安全性薬理試験を実施した。
III. 治験開始に向けた体制整備
1) 膵液漏発生率とリスク因子の検証：膵切除症例の手術成績を後ろ向きに解析した。
2) 手術室における撮像環境の評価：手術室環境で3種の撮像装置（システムA: 医療用内視鏡システムに515nm long-passカメラフィルターを装着, システムB: 上記Aの光源をLED光源に変更, システムC: 上記Bの撮像装置を非医療用カメラに変更）を用いてHMRGファントムを撮影した。
3) gPhe-HMRG製造工程の整備
ブタ体腔内で膵実質を自動縫合器で離断。キモトリプシンプローブ（gPhe-HMRG 50μMにtrypsin 400μg/mL添加） 200μLを散布。実験用蛍光イメージャーで観察した。
II. gPhe-HMRG, HMRGの非臨床安全性試験の実施
PMDA薬事戦略相談対面助言を受けて決定した非臨床安全性試験のうち、単回投与毒性試験、遺伝毒性試験、hERG電流に対する安全性薬理試験を実施した。
III. 治験開始に向けた体制整備
1) 膵液漏発生率とリスク因子の検証：膵切除症例の手術成績を後ろ向きに解析した。
2) 手術室における撮像環境の評価：手術室環境で3種の撮像装置（システムA: 医療用内視鏡システムに515nm long-passカメラフィルターを装着, システムB: 上記Aの光源をLED光源に変更, システムC: 上記Bの撮像装置を非医療用カメラに変更）を用いてHMRGファントムを撮影した。
3) gPhe-HMRG製造工程の整備
結果と考察
I. キモトリプシンプローブ最適化に関する検討
・キモトリプシンプローブ 200μLの散布により、膵液漏出部位が明瞭に描出された。蛍光シグナルはフィルター装着下に術者が肉眼観察可能であり、蛍光ガイド下に縫合処置し得た。
・膵液漏出部位では、プローブ散布後3分で蛍光強度が散布前の2.0～5.5倍に上昇したのに対し、非蛍光領域では散布後5分でも蛍光強度の上昇を認めなかった。
II. gPhe-HMRG, HMRGの非臨床安全性試験の実施
・試験実施範囲内で、gPhe-HMRGの毒性は示されなかった。HMRGには用量反応性の遺伝毒性を発現する可能性が示唆されたが、本プローブの投与法が微量（gPhe-HMRGとして最大約57.8μg）であり、散布後に十分量の生食で洗浄することを考慮すると、臨床使用に際する遺伝毒性のリスクは低いと推察された。
III. 治験開始に向けた体制整備
1) 膵切除における膵液漏発生率とリスク因子の検証
・膵切除62症例の検討では、国際基準 (ISGPF)によるgrade B以上の膵液漏の発生頻度は膵頭十二指腸切除で 31%、膵体尾部切除で33%であった。Clavien-Dindo分類grade III以上の術後合併症の発生頻度は、膵頭十二指腸切除で11%、膵体尾部切除で30%であった。
・Shear wave velocity（SWV）の計測に基づいて膵実質の硬さをhard pancreas, n = 30）とsoft pancreas（n = 32）に分けた場合、ISGPF grade B以上の術後膵液漏の発生率は後者の方が高かった（13％ vs. 63%, P = 0.001）。
2) 手術室における撮像環境の評価
・照明を全消灯し、システムAを用いて観察した場合、濃度1.0μMのHMRGが発する蛍光シグナルをモニター上で認識できた。天井灯を点灯しても濃度10μMのHMRGが発する蛍光シグナルを認識できたが、無影灯点灯下では蛍光シグナルが認識不能となった。システムBにより光源波長をHMRGに最適化（490nm）したが、光量不足のためか視認性は改善しなかった。手術室照明全消灯下にシステムCを用い、ISO感度を128,000以上に設定（exposure time: 4ms）すると、フィルターを介した肉眼観察と同様、最も低濃度（0.1μM）のHMRGサンプルを認識できた。手術操作に必要な背景の構造も十分に描出された。3) gPhe-HMRG製造工程の整備
・品質規格について検討し、強熱残分などを追加した。精製方法の見直しに関連し、含量測定方法を見直した。結晶化法を用いて精製することで、凍結乾燥作業の回避及びトリフルオロ酢酸の除去が可能となった。
・キモトリプシンプローブ 200μLの散布により、膵液漏出部位が明瞭に描出された。蛍光シグナルはフィルター装着下に術者が肉眼観察可能であり、蛍光ガイド下に縫合処置し得た。
・膵液漏出部位では、プローブ散布後3分で蛍光強度が散布前の2.0～5.5倍に上昇したのに対し、非蛍光領域では散布後5分でも蛍光強度の上昇を認めなかった。
II. gPhe-HMRG, HMRGの非臨床安全性試験の実施
・試験実施範囲内で、gPhe-HMRGの毒性は示されなかった。HMRGには用量反応性の遺伝毒性を発現する可能性が示唆されたが、本プローブの投与法が微量（gPhe-HMRGとして最大約57.8μg）であり、散布後に十分量の生食で洗浄することを考慮すると、臨床使用に際する遺伝毒性のリスクは低いと推察された。
III. 治験開始に向けた体制整備
1) 膵切除における膵液漏発生率とリスク因子の検証
・膵切除62症例の検討では、国際基準 (ISGPF)によるgrade B以上の膵液漏の発生頻度は膵頭十二指腸切除で 31%、膵体尾部切除で33%であった。Clavien-Dindo分類grade III以上の術後合併症の発生頻度は、膵頭十二指腸切除で11%、膵体尾部切除で30%であった。
・Shear wave velocity（SWV）の計測に基づいて膵実質の硬さをhard pancreas, n = 30）とsoft pancreas（n = 32）に分けた場合、ISGPF grade B以上の術後膵液漏の発生率は後者の方が高かった（13％ vs. 63%, P = 0.001）。
2) 手術室における撮像環境の評価
・照明を全消灯し、システムAを用いて観察した場合、濃度1.0μMのHMRGが発する蛍光シグナルをモニター上で認識できた。天井灯を点灯しても濃度10μMのHMRGが発する蛍光シグナルを認識できたが、無影灯点灯下では蛍光シグナルが認識不能となった。システムBにより光源波長をHMRGに最適化（490nm）したが、光量不足のためか視認性は改善しなかった。手術室照明全消灯下にシステムCを用い、ISO感度を128,000以上に設定（exposure time: 4ms）すると、フィルターを介した肉眼観察と同様、最も低濃度（0.1μM）のHMRGサンプルを認識できた。手術操作に必要な背景の構造も十分に描出された。3) gPhe-HMRG製造工程の整備
・品質規格について検討し、強熱残分などを追加した。精製方法の見直しに関連し、含量測定方法を見直した。結晶化法を用いて精製することで、凍結乾燥作業の回避及びトリフルオロ酢酸の除去が可能となった。
結論
臨床使用における投与法を「キモトリプシンプローブ（50μMのgPhe-HMRGにtrypsinを400μg/mLの濃度で添加）を膵断端に1回あたり500μL散布する」と設定した。また、単回投与毒性試験、遺伝毒性試験、及びhERG電流に対する安全性薬理試験を実施し、gPhe-HMRGの安全性を確認した。更に試験物の製造行程を改良し、手術室における撮像環境を確立した。
公開日・更新日
公開日
2016-01-28
更新日
-