ＨＩＶの潜伏・再活性化および慢性的免疫活性化を左右する細胞因子・免疫応答の解明とその制御

文献情報

• 文献番号: 201421008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ＨＩＶの潜伏・再活性化および慢性的免疫活性化を左右する細胞因子・免疫応答の解明とその制御
• 課題番号: H24-エイズ-一般-008
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 横田 恭子(東京工科大学 医療保険学部・臨床検査学科)

研究分担者(所属機関)

• 徳永　研三(国立感染症研究所　感染病理部)
• 渡邉　俊樹(東京大学　新領域創成科学研究科)
• 立川　愛(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 田中　勇悦(琉球大学大学院医学研究科)
• 小柳　義夫(京都大学　ウイルス研究所)
• 山本　浩之(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 三浦　智行(京都大学　ウイルス研究所)
• 上野　貴将(熊本大学　エイズ学研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 エイズ対策研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 23,027,000円
• 研究者交替、所属機関変更: 研究分担者交替 五十嵐樹彦（平成26年4月1日～平成26年10月31日）→三浦智行（平成26年11月1日以降） 研究機関異動 研究分担者 立川愛 東京大学医科学研究所（平成26年4月1日～平成27年1月31日）→ 国立感染症研究所 エイズ研究センター（平成27年2月1日以降）

研究報告書（概要版）

研究目的

HIVの潜伏感染とウイルス再活性化および慢性的免疫活性化によるT細胞の疲弊化を左右する細胞内因子および免疫学的要因を明らかにすることにより、エイズ病態を制御する新規治療戦略のための基盤を確立する。

研究方法

SIVmac239初期制御2年後の制御2頭とエスケープ変異出現1頭にIL-7+IL-15を投与し、Tメモリー分画の変動、SIV特異的CTL応答、血中ウイルス量を測定した。非病原性SIVの直腸感染後潜伏化したサル3頭に抗CD8抗体を投与し、リンパ節の免疫細胞の変化を解析した。ヒト化マウスにR5型HIV-1とそのVif変異体を接種し、CD4細胞数、HIV RNAとDNA量、血中ウイルス配列を解析した。初期培養CD4細胞にウイルスを感染させた後、IL-7とIL-15を添加して培養維持し、感染細胞頻度やその性状、mRNA発現、integration効率を定量した。LTRの下流にVenus、EFプロモーター下にmRFP遺伝子を挿入したdual-color reporterウイルスを作製してCD4細胞に感染させ、抗CD3/CD28抗体で刺激した。I型IFN関連遺伝子、IFITM1、IFITM2、IFITM3、ISG15及びRSAD2の安定発現あるいはCRISPR/Cas9による安定ノックアウト細胞にHIVレポーターウイルスを感染させた。HLA-A24発現ACH-2細胞株をTNF-alphaで再活性化後にHLA-A*24:02拘束性CTLエピトープ特異的CTLクローンと共培養し、経時的にIFN-gammaエリスポット法で解析した。HIVコントローラーと急性感染者検体のnef遺伝子をプロウイルスベクターに組み込み、遺伝子系統樹や医学統計による比較、個体内遺伝子変動とNefの機能の関係を解析した。抗CCR5やCXCR4抗体による活性化PBMCへのR5型HIV-1感染抑制効果を測定した。

結果と考察

SIV初期制御サルのSIV制御は、恒常性維持増殖 (HSP)因子であるIL-7とIL-15の効果には影響されないこと、弱毒SIV潜伏感染サルのCD8細胞による抑制解除後にリンパ節中の制御T細胞が早期の感染標的となりうることが示された。濾胞中のヘルパーT細胞はSIVに持続感染していることが報告されており、SIV制御サルではCTLがSIV再増殖に即時に対応して血中ウイルス量を検出限界以下におさえていると推察される。また、ヒト化マウスのHIV-1感染ではAPOBEC亜種の異なる機能がもたらす生体内ウイルス変異蓄積の特徴が明らかにされた。これらの情報はHIV初期制御と潜伏後のウイルスの性状やそれに関わる病態解明に向けた重要な知見である。HSP培養で維持される静止期ナイーブCD4細胞の潜伏感染は、強力なTCR刺激後の記憶CD4細胞とは異なるLTR制御を受けていることや、HIV-1感染早期に潜伏化の成立に関わる多様な分子メカニズムの存在が明らかにされ、新たな再活性化因子検索を開始した。更に、HIV潜伏感染細胞の再活性化を高感度に検知するシステムの構築、HIV感染者の抗ウイルス免疫応答とNef機能を左右するnef遺伝子変異の関係、I型IFNの強力なHIV-1感染前期抑制効果がIFITMファミリー蛋白や未知の遺伝子を含む複数のI型IFN関連遺伝子によること、CCR5やCXCR4に対する抗体によるHIV-1抑制性βケモカイン産生誘導とHIV-1感染拡大阻止効果等、今後の新たな治療法開発のための有用な情報を提供した。

結論

SIV初期制御サルにIL-7+IL-15を投与してもSIV再活性化はなく、弱毒SIV潜伏感染サルのCD8によるSIV抑制解除による制御T細胞への感染が示唆された。ヒト化マウスではAPOBEC亜種の異なる機能による生体内HIV変異が明らかになった。恒常性維持培養では静止期ナイーブCD4細胞の潜伏感染が記憶CD4細胞とは異なるLTR制御を受けていること、HIV-1潜伏化成立の分子メカニズムは初期と後期で異なることから、新たな再活性化因子検索系を確立した。更に、HIV潜伏感染細胞の再活性化抗原検出系の構築、Nefの機能と抗ウイルス免疫応答の関連性、IFITMファミリーを含む複数の未知遺伝子がI型IFNの強力なHIV-1感染前期抑制を担うこと、CCR5やCXCR4抗体によるHIV-1抑制性βケモカイン産生誘導とHIV-1感染拡大阻止等、初期制御・潜伏後のウイルスの性状やそれに関わる病態等、多くの重要な知見が得られた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-09
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201421008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ＨＩＶの潜伏・再活性化および慢性的免疫活性化を左右する細胞因子・免疫応答の解明とその制御
• 課題番号: H24-エイズ-一般-008
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 横田 恭子(東京工科大学 医療保険学部・臨床検査学科)

研究分担者(所属機関)

• 徳永　研三(国立感染症研究所　感染病理部)
• 渡邉　俊樹(東京大学　新領域創成科学研究科)
• 立川　愛(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 田中　勇悦(琉球大学大学院医学研究科)
• 小柳　義夫(京都大学　ウイルス研究所)
• 山本　浩之(国立感染症研究所　エイズ研究センター)
• 五十嵐　樹彦(京都大学　ウイルス研究所)
• 三浦　智行(京都大学　ウイルス研究所)
• 上野　貴将(熊本大学　エイズ学研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 エイズ対策研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 所属機関異動 研究分担者 立川愛 東京大学医科学研究所（平成26年4月1日～平成27年1月31日）→ 国立感染症研究所 エイズ研究センター（平成27年2月1日以降）

研究報告書（概要版）

研究目的

HIVの潜伏感染とウイルス再活性化および慢性的免疫活性化によるT細胞の疲弊化を左右する細胞内因子および免疫学的要因を明らかにすることにより、エイズ病態を制御する新規治療戦略のための基盤を確立する。

研究方法

SIV初期制御2年目のSIV制御群とエスケープ変異出現群における抗CD8抗体あるいはIL-7+IL-15投与後のSIV増殖と変異蓄積、非病原性SIVの直腸感染後潜伏化したサルのSIV再活性化に伴うリンパ節細胞の変化を解析した。ヒト化マウスでは、X4とR5型HIV-1の同時感染、野生型とVprあるいはVif変異HIV-1の感染において、生体内での感染細胞の性状やHIV変異蓄積を解析した。ナイーブCD4細胞をIL-7とIL-15添加(HSP)培養維持するHIV潜伏感染モデルの確立、LTRとEFプロモーター下に2種の遺伝子を挿入したレポーターウイルス感染後の潜伏感染のエピジェネティック制御解析を行った。I型IFN関連遺伝子の安定発現あるいはCRISPR/Cas9によるノックアウト細胞にHIVレポーターウイルスを感染させた。HIV感染者由来CD4とCD8細胞のIL-2発現およびプロモーター領域のDNAメチル化、細胞表面抗原を解析し、HLA-A24発現ACH-2細胞株(A24-ACH2)をTNFで再活性化してHLA-A*24:02拘束性CTLエピトープ特異的CTLクローンとの反応をIFN-gammaエリスポット法で評価した。感染制御者と急性感染者検体のnef遺伝子をウイルスに組み込み、遺伝子配列とNefの機能に関する系統樹や統計学解析を行った。HTLV-1で不死化した自家T細胞株のOX40L発現、抗CCR5やCXCR4抗体によるR5型HIV-1の感染抑制効果を測定した。

結果と考察

SIV初期制御サルはIL-7+IL-15には影響されず、CD8制御下でもウイルス変異が蓄積していたことから、SIV再増殖にCTLが即時に対応して血中ウイルス量が検出限界以下に抑制されていること、弱毒SIV潜伏感染サルのSIV抑制解除後は制御性T細胞が早期感染標的となりうることが示された。一方、ヒト化マウスのX4とR5型HIV-1同時感染において、R5型共存下のCCR5陽性記憶CD4細胞へのX4型感染頻度は細胞傷害性とは関係なく低下していること、vpr欠損株感染において制御性T細胞の選択的枯渇がT細胞の活性化・ウイルス増殖促進の要因であること、vif変異株感染においてAPOBEC亜種の異なる機能と生体内ウイルス変異の関係が明らかになった。また、HSP培養維持静止期ナイーブCD4細胞の潜伏感染は、強力なTCR刺激後の記憶CD4細胞のそれとは異なるLTR制御を受けていること、感染初期にLTRが不活性化する集団と時間依存的に潜伏化する集団ではLTR上のヒストン修飾や再活性化シグナルに対する感受性が異なることがわかり、新たな再活性化因子検索を開始した。更に、HIV-1感染者CD4細胞のIL-2遺伝子高度メチル化の頻度はIL-2発現量と逆相関し老化マーカーCD57発現とは正の相関があること、HIV潜伏感染の再活性化検出系の構築、HIV感染者の抗ウイルス免疫応答とnef変異との関係、IFITMファミリーや未知の遺伝子が複数関与するI型IFN関連遺伝子の強力なHIV-1感染抑制効果、OX40L刺激や抗CCR5やCXCR4抗体によるHIV-1抑制性βケモカイン産生誘導と感染拡大阻止効果等、多くの知見が蓄積された。

結論

サルとヒト化マウスモデルを用い、SIV感染制御サルでもGag特異的CTL変異蓄積を伴う持続感染があるがIL-7+IL-15投与で再活性化に至らないこと、再活性化初期の制御性T細胞が感染標的となりうること、R5有意の感染伝播の再現、APOBEC亜種によるHIV増殖制御と生体内HIV多様性との関係、が明らかとなった。培養系では、恒常的に維持されるナイーブCD4細胞とT細胞受容体刺激を受けたメモリーCD4細胞のLTR制御の違い、T細胞亜集団の分化・活性化度に依存するエピジェネティック制御因子の違いが、また、HIV特異的CTLによる潜伏再活性化検知系が開発され、HIV感染制御者の免疫応答によるHIV Nef機能の減弱とウイルスの逃避変異の関係が示された。一方、HIV-1感染抑制を担う未知のI型IFN関連遺伝子の存在、OX40Lや抗ケモカイン受容体抗体によるR5HIV-1感染抑制機構等、新たな治療法開発のための基盤を提供した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-09
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201421008C

収支報告書

• 文献番号: 201421008Z