文献情報
文献番号
201306001A
報告書区分
総括
研究課題名
幹細胞による次世代の低侵襲軟骨再生治療の開発と臨床応用
課題番号
H23-再生-一般-001
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
関矢 一郎(東京医科歯科大学 再生医療研究センター)
研究分担者(所属機関)
- 宗田 大(東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 運動器外科学)
- 森尾 友宏(東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 発生発達病態学)
- 清水 則夫(東京医科歯科大学 難治疾患研究所 ウイルス治療学)
- 赤澤 智宏(東京医科歯科大学 大学院保健衛生学研究科 分子生命情報解析学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
32,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
滑膜幹細胞を集合体に形成することにより移植の操作性および細胞の接着性が向上し、軟骨への分化も良好であることをウサギを用いた研究で確認している。平成25年度は、大動物のマイクロミニピッグで、滑膜幹細胞集合体の有効性を検証することを目的とした。感染症検査システムとして、ウイルス・マイコプラズマを検出するTMDU法を開発した。平成25年度は、マイコプラズマ検査系の感度を検証するバリデーション試験の実施、ウイルス検査系の自動化を目的とした。変異細胞評価システムとして、リン酸化ATM,p53の免疫組織染色、DNA修復応答系AIDの定量、腫瘍化前段階を検出する系としてメチル化p16の定量系を確立した。平成25年度は、滑膜幹細胞および集合体22検体で変異細胞評価をすることを目的とした。組織採取の侵襲やin vitroにおける継代培養の限界のない次世代の軟骨再生治療を目標として、平成25年度は軟骨誘導に適したiPS細胞のスクリーニング、iPS細胞の集合体をラット軟骨欠損部に移植し、移植組織における軟骨分化マーカー等の解析、軟骨再生を検証することを目的とした。
研究方法
1. 大動物を用いた軟骨再生研究
マイクロミニピッグの滑膜より間葉系幹細胞を分離・培養し、hanging drop法で約1mmの集合体（2.5×105 cells/個）を作製した。膝蓋大腿関節の大腿骨側と大腿骨内顆に6×6×1.5mmの軟骨欠損を作製し、自家滑膜幹細胞集合体を16個ずつ移植し、4週後に肉眼的、組織学的解析を行った。また、GFP発現ピッグの滑膜幹細胞集合体を同種移植し、移植後の細胞動態を解析した。
2. 感染症検査システムの検討
日本・欧州・米国の3極薬局方記載の9種類を含む17種類のマイコプラズマをTMDU法にて定量して検出感度を調べた。また、現在汎用されているマイコプラズマ検出キットMycoSEQとTMDU法の比較試験を行った。さらに、13種のウイルスを添加した測定用サンプルからQIAsymphonyでDNAを自動抽出し、TMDU法にてウイルスを定量した。
3. 変異細胞評価システムの検討
滑膜間葉系幹細胞22検体より核酸を抽出し、リアルタイムPCRにてメチル化p16およびAIDを定量した。また、リン酸化ATM,p53の免疫組織染色を行った。
4. iPS細胞での検討
3種のiPS細胞株（A株:MEF由来Nanog GFP/SOX10DsRed-iPSCs, B株:MEF由来Nanog GFP-iPSCs, C株:MEF由来Oct GFP-iPSCs）をペレット培養法によりin vitroで軟骨に分化誘導し、軟骨分化しやすい株を選別した。また、選別したiPS細胞の集合体を作製しラット軟骨欠損部へ移植し、4週後に組織学的解析、遺伝子発現解析を行った。
マイクロミニピッグの滑膜より間葉系幹細胞を分離・培養し、hanging drop法で約1mmの集合体（2.5×105 cells/個）を作製した。膝蓋大腿関節の大腿骨側と大腿骨内顆に6×6×1.5mmの軟骨欠損を作製し、自家滑膜幹細胞集合体を16個ずつ移植し、4週後に肉眼的、組織学的解析を行った。また、GFP発現ピッグの滑膜幹細胞集合体を同種移植し、移植後の細胞動態を解析した。
2. 感染症検査システムの検討
日本・欧州・米国の3極薬局方記載の9種類を含む17種類のマイコプラズマをTMDU法にて定量して検出感度を調べた。また、現在汎用されているマイコプラズマ検出キットMycoSEQとTMDU法の比較試験を行った。さらに、13種のウイルスを添加した測定用サンプルからQIAsymphonyでDNAを自動抽出し、TMDU法にてウイルスを定量した。
3. 変異細胞評価システムの検討
滑膜間葉系幹細胞22検体より核酸を抽出し、リアルタイムPCRにてメチル化p16およびAIDを定量した。また、リン酸化ATM,p53の免疫組織染色を行った。
4. iPS細胞での検討
3種のiPS細胞株（A株:MEF由来Nanog GFP/SOX10DsRed-iPSCs, B株:MEF由来Nanog GFP-iPSCs, C株:MEF由来Oct GFP-iPSCs）をペレット培養法によりin vitroで軟骨に分化誘導し、軟骨分化しやすい株を選別した。また、選別したiPS細胞の集合体を作製しラット軟骨欠損部へ移植し、4週後に組織学的解析、遺伝子発現解析を行った。
結果と考察
1. 大動物を用いた軟骨再生研究
移植4週後の肉眼的、組織学的解析の結果、マイクロミニピッグにおいても良好な軟骨の再生が確認できた。今後ヒトへの臨床応用が期待できる。
2. 感染症検査システムの検討
TMDU法は17種類全てのマイコプラズマを5cfu/reactionの感度で検出できた。感度・直線性・特異性に関しては、TMDU法は汎用されているマイコプラズマキットMycoSEQと同等であったが、MycoSEQで見られる偽陽性反応がなく結果の解釈がより簡便であった。また、13種全てのウイルスを10copies/reactionの感度で自動測定が可能であり、10〜104コピーの範囲で直線性のある定量データが得られ、実用化するために十分な性能を持つことが示唆された。
3. 変異細胞評価システムの検討
滑膜間葉系幹細胞22検体すべてでメチル化P16は陰性、AIDも陰性（1例では検出感度以下の弱陽性）であった。
4. iPS細胞での検討
3種類のiPS細胞株のうちB株が最も軟骨に分化しやすかった。iPS細胞を集合体にすることによりNanog遺伝子の発現は低下した。iPS細胞B株の集合体をラット軟骨欠損部に移植すると、滑膜幹細胞集合体と同様に良好な軟骨の再生が確認できた。移植組織ではCol2a1,Sox9,Aggrecan遺伝子発現の上昇、Nanog遺伝子発現の低下が確認できた。
移植4週後の肉眼的、組織学的解析の結果、マイクロミニピッグにおいても良好な軟骨の再生が確認できた。今後ヒトへの臨床応用が期待できる。
2. 感染症検査システムの検討
TMDU法は17種類全てのマイコプラズマを5cfu/reactionの感度で検出できた。感度・直線性・特異性に関しては、TMDU法は汎用されているマイコプラズマキットMycoSEQと同等であったが、MycoSEQで見られる偽陽性反応がなく結果の解釈がより簡便であった。また、13種全てのウイルスを10copies/reactionの感度で自動測定が可能であり、10〜104コピーの範囲で直線性のある定量データが得られ、実用化するために十分な性能を持つことが示唆された。
3. 変異細胞評価システムの検討
滑膜間葉系幹細胞22検体すべてでメチル化P16は陰性、AIDも陰性（1例では検出感度以下の弱陽性）であった。
4. iPS細胞での検討
3種類のiPS細胞株のうちB株が最も軟骨に分化しやすかった。iPS細胞を集合体にすることによりNanog遺伝子の発現は低下した。iPS細胞B株の集合体をラット軟骨欠損部に移植すると、滑膜幹細胞集合体と同様に良好な軟骨の再生が確認できた。移植組織ではCol2a1,Sox9,Aggrecan遺伝子発現の上昇、Nanog遺伝子発現の低下が確認できた。
結論
滑膜幹細胞集合体は移植操作が容易で、ピッグにおいても軟骨再生に有効であった。確立した変異細胞評価システムで滑膜幹細胞22検体を検証した結果、DNA損傷は最小限であり、明らかな腫瘍化の徴候も認められなかった。TMDU法は17種類のマイコプラズマを5cfu/reactionの感度で検出可能であり、QIAsymphonyの導入により自動検査が可能であった。軟骨分化しやすいiPS細胞を軟骨欠損部に移植することにより、次世代の軟骨再生治療も可能である。
公開日・更新日
公開日
2015-03-03
更新日
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