化審法における監視化学物質・優先評価化学物質の長期毒性評価スキームの創出に関する研究

文献情報

• 文献番号: 202226002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 化審法における監視化学物質・優先評価化学物質の長期毒性評価スキームの創出に関する研究
• 課題番号: 20KD1002
• 研究年度: 令和4(2022)年度
• 研究代表者(所属機関): 鰐渕 英機(大阪公立大学 大学院医学研究科)

研究分担者(所属機関)

• 鈴木　周五(大阪公立大学大学院医学研究科)
• 豊田　武士(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター・病理部)
• 横平　政直(香川大学　医学部　腫瘍病理学)
• 加藤　寛之(名古屋市立大学　大学院医学研究科実験病態病理学)
• 魏　民(大阪公立大学　大学院医学研究科)
• 戸塚　ゆ加里(日本大学薬学部　環境衛生学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和2(2020)年度
• 研究終了予定年度: 令和4(2022)年度
• 研究費: 19,239,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

化審法の規制区分「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」には、スクリーニング毒性試験の結果から健康影響の懸念を評価されているものの、慢性毒性や発がん性が不明の物質が多く存在する。しかし、それらの物質を全て長期試験により検討することは、莫大な費用や時間等を必要とするため困難である。そこで、化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に評価できる試験法及び試験スキームの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要であり、国民生活の安全･安心を保証する。
本研究では化学物質の標的となる臓器の大半は肝臓であることに着目し、肝発がん性を短期で高精度に検証できるシステムを確立するとともに、問題となる「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」について肝発がん性評価を行った。5研究施設の協同体制にて下記の研究を実施した。我々が以前に開発した「遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法」及び「DNAアダクトーム解析による遺伝毒性評価」はいずれも正答率が9割を超える高精度試験系であるが、「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」を含め化学物質数を増やし、より信頼性の高い評価法へと発展させた。加えて、「遺伝子セットを用いた非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法」を確立した。

研究方法

非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法の検証は、OECDテストガイドラインのTG407：げっ歯類における28日間反復経口投与毒性試験法に則って、ラットに被験物質投与を行い、肝臓における遺伝子発現についてマイクロアレイにより取得した。今年度は、被検物質として優先評価物質6種類を含む合計10種を28日間における最大投与用量で投与した。肝発がん性の予測において、これまでに構築した非遺伝毒性肝発がん物質検出法の検出感度をさらに高めるため、遺伝子セットについて再選定し、新たな検出モデルを構築し判定を行った。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法の検証試験では、ラットに被験物質の単回強制胃内投与試験を行った。これまでの検出モデル-1を用いた検討において偽陰性となった遺伝毒性肝発がん物質の5種類について新たな肝発がん検出モデル-2を作成し検討した。投与24時間後の肝臓における網羅的遺伝子発現解析を行い、優先評価化学物質であるo-phenylenediamine、既知の遺伝毒性肝発がん物質である1-amino-2,4-dibromoanthraquinoneを陽性とするモデル(検出モデル-2)を作成し、5種類の物質について判定を行った。
高分解能精密質量分析装置を用いたDNA付加体の網羅的解析（DNAアダクトーム）を用いて、遺伝毒性および肝発がん性の異なる物質の肝臓におけるDNA損傷の詳細な評価を行なった。毒性予測モデルの更なる正答率向上に向け、得られたデータに対して標準化を行い、遺伝毒性予測ラベルと発がん性予測ラベルを作成し、ランダムフォレスト(RF)と線形判別分析（LDA）及びLeave-One-Out交差検証による機械学習手法により検討した。

結果と考察

非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法の検証において、これまで検討した89物質について、従来モデルでは感度39%、特異度100%と判定された。感度および特異度の改善のため、3つの異なる発がん機序ごとにモデルを作成し、その成果を統合するモデル（機序別統合モデル）は、感度64%（23/36物質）、特異度94%（50/53物質）、正答率が82%（73/89物質）となる高い精度で検出できる可能性が示唆された。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法の検証試験において、検出モデル-1で偽陰性となった5物質のうち4物質が陽性判定とされる検出モデル-2構築が出来た。我々の開発した2つの検出モデルを組み合わせて用いることで、遺伝毒性肝発がん物質を感度97%及び特異度95%と、高い精度で検出可能であった。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法で得られた肝組織を用いたDNAアダクトーム解析による評価ではRFよりもLDAを用いた結果が良好であり、発がん性（83％）および遺伝毒性（65%）を予測するモデルが作成できた。

結論

遺伝子セットを用いた非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法では、感度64%、特異度84%、正答率が82%、遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法では、感度97%、特異度95%、正答率が96%と、いずれも高い精度で検出できる可能性が示唆された。DNAアダクトーム解析及び線形判別分析により、遺伝毒性や肝発がん性の有無を分別できる可能性を示した。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-07-31
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202226002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 化審法における監視化学物質・優先評価化学物質の長期毒性評価スキームの創出に関する研究
• 課題番号: 20KD1002
• 研究年度: 令和4(2022)年度
• 研究代表者(所属機関): 鰐渕 英機(大阪公立大学 大学院医学研究科)

研究分担者(所属機関)

• 鈴木　周五(大阪公立大学大学院医学研究科)
• 豊田　武士(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター・病理部)
• 横平　政直(香川大学　医学部　腫瘍病理学)
• 加藤　寛之(名古屋市立大学　大学院医学研究科実験病態病理学)
• 魏　民(大阪公立大学　大学院医学研究科)
• 戸塚　ゆ加里(日本大学薬学部　環境衛生学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 令和2(2020)年度
• 研究終了予定年度: 令和4(2022)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

化審法の規制区分「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」には、スクリーニング毒性試験の結果から健康影響の懸念を評価されているものの、慢性毒性や発がん性が不明の物質が多く存在する。しかし、それらの物質を全て長期試験により検討することは、莫大な費用や時間等を必要とするため困難である。そこで、化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に評価できる試験法及び試験スキームの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要であり、国民生活の安全･安心を保証する。
本研究では化学物質の標的となる臓器の大半は肝臓であることに着目し、肝発がん性を短期で高精度に検証できるシステムを確立するとともに、問題となる「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」について発がん性評価を行った。5研究施設の協同体制にて下記の研究を実施した。我々が以前に開発した「遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法」及び「DNAアダクトーム解析による遺伝毒性評価」はいずれも正答率が9割を超える高精度試験系であるが、「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」を含め、評価対象化学物質数を増やし、より信頼性の高い評価法へと発展させた。加えて、「遺伝子セットを用いた非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法」を確立した。

研究方法

非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法の検証は、令和2〜4年度にかけて非遺伝毒性肝発がん物21種類と、非肝発がん物質11種類の化学物質について、OECDテストガイドラインのTG407：げっ歯類における28日間反復経口投与毒性試験法に則って、ラットに被験物質投与を行い、肝臓における遺伝子発現についてマイクロアレイにより取得した。肝発がん性の予測において、これまでに構築した非遺伝毒性肝発がん物質検出法の検出感度の向上を目的とし、遺伝子セットを再選定した新たな検出法を構築し判定を行った。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法の検証試験では、ラットに「監視化学物質」及び「優先評価化学物質」を含む6化学物質を単回強制胃内投与する試験を行った。また、これまでに開発した検出モデル-1で偽陰性となった遺伝毒性肝発がん物質の5種類について、教師データの更新を行った事による新たな肝発がん検出モデル-2を作成した。投与24時間後の肝臓における網羅的遺伝子発現解析を行い、5種類の物質について判定を行った。
高分解能精密質量分析装置を用いたDNA付加体の網羅的解析（DNAアダクトーム）を用いて、遺伝毒性および肝発がん性モデルの評価を行なった。令和2年度は以前に作成したモデルの解析対象物質全てで評価を行い、令和3〜4年度は正答率向上に向けデータの標準化を行うことで、遺伝毒性予測ラベルと発がん性予測ラベルを作成しランダムフォレスト(RF)と線形判別分析（LDA）及びLeave-One-Out交差検証による機械学習手法により検討した。

結果と考察

非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法の検証において、上記の動物実験を行った32種類とともにOpen TG-GATEに登録されている57種類を合わせた合計89物質について、従来モデルでは感度39%、特異度100%と判定された。感度および特異度の改善のため、3つの異なる発がん機序ごとにモデルを作成し、その成果を統合するモデル（機序別統合モデル）は、感度64%（23/36物質）、特異度94%（50/53物質）、正答率が82%（73/89物質）となる高い精度で検出できる可能性が示唆された。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法の検証試験において、これまでの検出モデル-1では感度83%、特異度95%、正答率90%の精度で検出できた。さらに、新モデル作成に用いた2物質を含む合計4物質が陽性判定とされる検出モデル-2の構築が出来た。我々の開発した2つの検出モデルを組み合わせて用いることで、遺伝毒性肝発がん物質が感度97%及び特異度95%と、高い精度で検出可能となった。
遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法で得られた肝組織を用いたDNAアダクトーム解析による評価では、令和2年度は検出モデルごとに予測精度が異なり、解析物質数を増やすと精度の低下を認めた。令和3〜4年度にかけて新しく構築したモデルにおいて、RFよりもLDAを用いた結果が良好であることが明らかとなり、発がん性（83％）および遺伝毒性（65%）を予測するモデルが作成できた。

結論

遺伝子セットを用いた非遺伝毒性肝発がん物質短期検出法では、感度64%、特異度84%、正答率が82%、遺伝子セットを用いた遺伝毒性肝発がん物質超短期検出法では、感度97%、特異度95%、正答率が96%と、いずれも高い精度で検出できる可能性が示唆された。DNAアダクトーム解析及び線形判別分析により、遺伝毒性や肝発がん性の有無を分別できる可能性が示唆された。

公開日・更新日

• 公開日: 2023-07-31
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202226002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究において、遺伝毒性肝発がん物質を高い精度で検出できる超短期肝発がん性予測モデルとともに、非遺伝毒性肝発がん物質についても高い精度で検出できる短期肝発がん予測モデルを開発・改良し、監視化学物質や優先評価化学物質を含む多数の化学物質で検証した。また、DNA損傷を指標とした化学物質の肝発がん性・遺伝毒性分類の精度が向上し、これらモデルを用いた遺伝毒性に基づく総合的な肝発がん物質予測スキームが開発できた。
• 臨床的観点からの成果: なし
• ガイドライン等の開発: 本研究で開発した遺伝毒性肝発がん物質を高い精度で検出できる遺伝子セットを用いた超短期肝発がん性予測モデルのOECDテストガイドライン化および、非遺伝毒性肝発がん物質を高い精度で検出できる短期肝発がん予測モデルを既存のOECDテストガイドライン（TG407：28日間反復経口投与毒性試験）にオプションとして追加する改定案を目指す。
• その他行政的観点からの成果: 生活環境を取り巻く化学物質の発がん性を迅速に、かつ高精度に検証できるシステムの確立は、社会的にも経済的にも非常に重要である。本研究で開発した総合的な肝発がん物質予測スキームは、そのシステム確立に貢献できる成果であり、厚生労働行政施策の科学的基盤となり得る。また、得られた監視化学物質や優先評価化学物質の発がん性に関する情報は厚生労働行政施策への活用が期待される。以上より、本研究は国民を取り巻く生活環境における化学物質の発がん性評価と国のがん予防施策に貢献し、社会へ還元できる研究である。
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 19件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 72件
• 学会発表(国際学会等): 9件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Toyoda T, Sone M, Ogawa K. et al.; Early detection of hepatocarcinogens in rats by immunohistochemistry of γ-H2AX.; J Toxicol Sci , in press (2023)
• 原著論文2: Matsushita K, Toyoda T, Ogawa K. et al.; A 13-week subchronic toxicity study of heme iron in SD rats.; Food Chem Toxicol. , 175 , 113702-113702 (2023)
• 原著論文3: Yamada T, Toyoda T, Ogawa K. et al.; Persistent γ-H2AX formation and expression of stem cell markers in N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced bladder carcinogenesis in rats.; Toxicol Sci , 189 , 51-61 (2022)
• 原著論文4: Toyoda T, Ogawa K.; Early detection of urinary bladder carcinogens in rats by immunohistochemistry for γ-H2AX: a review from analyses of 100 chemicals.; J Toxicol Pathol , 35 , 283-298 (2022)
• 原著論文5: Matsue T, Gi M, Wanibuchi H. et al.; The carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide inhibits urinary bladder cancers via suppression of beta-catenin signaling.; Cancer Sci , 113 , 2642-2653 (2022)
• 原著論文6: Kobayashi T, Toyoda T, Totsuka Y. et al.; Cytotoxic homo- and hetero-dimers of o-toluidine, o-anisidine, and aniline formed by in vitro metabolism.; Chem Res Toxicol , 35 , 1625-1630 (2022)
• 原著論文7: Akane H, Toyoda T, Ogawa K. et. al.; Histopathological and immunohistochemical evaluation for detecting changes in blood hormone levels caused by endocrine disruptors in a 28-day repeated-dose study in rats.; J Appl Toxicol , 42 (10) , 1603-1617 (2022)
• 原著論文8: Yamada T, Toyoda T, Ogawa K. et. al.; Expression of stem cell markers as useful complementary factors in the early detection of urinary bladder carcinogens by immunohistochemistry for gamma-H2AX.; Arch Toxicol , 95 , 715-726 (2021)
• 原著論文9: Toyoda T, Matsushita K, Ogawa K. et. al.; A 13-week subchronic toxicity study of 2-(l-menthoxy)ethanol in F344 rats.; J Toxicol Pathol , 34 , 309-317 (2021)
• 原著論文10: Totsuka Y, Watanabe M, Lin Y.; New horizons of DNA adductome for exploring environmental causes of cancer.; Cancer Sci , 112 , 7-15 (2021)
• 原著論文11: Kobayashi T, Toyoda T, Totsuka Y. et al.; o-Anisidine Dimer, 2-Methoxy-N(4)-(2-methoxyphenyl) Benzene-1,4-diamine, in Rat Urine Associated with Urinary bladder Carcinogenesis.; Chem Res Toxicol , 34 , 912-919 (2021)
• 原著論文12: Kakehashi A, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Canopy Homolog 2 as a Novel Molecular Target in Hepatocarcinogenesis.; Cancers (Basel) , 13 , 3613-3613 (2021)
• 原著論文13: Kakehashi A, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Cache Domain Containing 1 Is a Novel Marker of Non-Alcoholic Steatohepatitis-Associated Hepatocarcinogenesis.; Cancers (Basel) , 13 , 1216-1216 (2021)
• 原著論文14: Yokohira M, Hashimoto N, Imaida K. et al.; Lung proliferative lesion-promoting effects of left pulmonary ligation in A/J female mice.; Pathol Int , 70 , 340-347 (2020)
• 原著論文15: Totsuka Y, Gi M, Wanibuchi H. et al.; Comprehensive analysis of DNA adducts (DNA adductome analysis) in the liver of rats treated with 1,4-dioxane.; Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci , 96 , 180-187 (2020)
• 原著論文16: Tajima Y, Toyoda T, Totsuka Y. et al.; Novel o-Toluidine Metabolite in Rat Urine Associated with Urinary Bladder Carcinogenesis.; Chem Res Toxicol , 33 , 1907-1914 (2020)
• 原著論文17: Suzuki S, Gi M, Wanibuchi H. et al.; Role of gamma-H2AX as a biomarker for detection of bladder carcinogens in F344 rats.; J Toxicol Pathol , 33 , 279-285 (2020)
• 原著論文18: Kakehashi A, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Accumulation of 8-hydroxydeoxyguanosine, L-arginine and Glucose Metabolites by Liver Tumor Cells Are the Important Characteristic Features of Metabolic Syndrome and Non-Alcoholic Steatohepatitis-Associated Hepatocarcinogenesis.; Int J Mol Sci , 21 , 7746-7746 (2020)
• 原著論文19: Fujioka M, Suzuki S, Wanibuchi H. et al.; Dimethylarsinic acid (DMA) enhanced lung carcinogenesis via histone H3K9 modification in a transplacental mouse model.; Arch Toxicol , 94 , 927-937 (2020)

公開日・更新日

• 公開日: 2023-07-31
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 202226002Z