文献情報
文献番号
200000743A
報告書区分
総括
研究課題名
内分泌かく乱物質に対する感受性の動物種差の解明:チトクロームP450発現を指標として(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
出川 雅邦(静岡県立大学)
研究分担者(所属機関)
- 加藤善久(静岡県立大学)
- 根本清光(静岡県立大学)
- 梅原 薫(静岡県立大学)
- 横井 毅(金沢大学)
- 藤井宏融(呉大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
25,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
TCDDやPCBなどの代表的な内分泌かく乱物質には、肝チトクロームP450(以下P450と略す)の発現を変動させる性質があることが知られている。P450はホルモンの生合成や代謝および外来性化合物(内分泌かく乱物質、がん原性化合物、医薬品など)の代謝を担っており、生体におけるホルモンバランスの維持や外来性化合物の薬効・毒性発現と深く関わっている。一方また、P450には種々の分子種が存在すること、また、それらはそれぞれ異なった外来性化合物で誘導されること、さらに、その誘導には動物種差、性差、臓器差などがあることが知られている。したがって、P450各分子種の量的変動を指標とした内分泌かく乱物質の研究は、内分泌かく乱作用発揮に至る作用経路や内分泌かく乱物質に対するヒトを含めた動物種差、性差を理解するうえで不可欠である。そこで、本研究では内分泌かく乱物質のヒトや種々動物に対する的確な危険度評価法を確立する一環として、内分泌かく乱物質曝露時における種々動物でのP450発現の変動と内分泌かく乱作用との関連性を追究するとともに、種差を生む生体要因を解明することを目的とした。また、これまで植物性内分泌かく乱物質としては、エストロゲン様作用化合物が注目を浴び、多数の化合物が分離・同定されてきているが、その他のホルモン様作用化合物についての研究は数少ない。そこで、本研究では、糖代謝のみならずストレスや中枢神経系機能の調節に深く関わるグルココルチコイド(GC)に焦点を合わせ、食用植物や生薬中のGC様作用物質を検索する。
研究方法
研究項目別に以下研究方法を記述する。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
non-planar PCBの2,2',4',5,5'-ペンタクロロビフェニール(PentaCB: CB101)や2,2',3',4',5,6-ヘキサクロロビフェニール(HexaCB: CB132)の他、これら化合物を含むKC500を試料として、ラットとマウスに投与し、種々臓器重量の変動や、肝チトクロームP450(P450 と略す)などの薬物代謝酵素の発現変動を測定するとともに、精巣でのアンドロゲン生合成酵素遺伝子発現への影響をRT-PCR法を用いて検討した。また同時に、血中の甲状腺ホルモン(T4)量やテストステロン量を測定し、薬物代謝酵素の発現変動との関連性を追究した。また同様に、精巣におけるアンドロゲン生合成阻害や肝増殖作用がある鉛イオン(硝酸鉛)をラットやマウスに投与し、肝や精巣における薬物やステロイドホルモンの代謝に関わる酵素(P450分子種:CYP1A1/2, 3A1/3A2など)や ステロイドホルモン生合成に関わる酵素(HMG-CoA reductase、CYP51、CYP11, CYP17など)の遺伝子発現をRT-PCR法を用いて比較検討した。さらに、神経細胞のみならず血管平滑筋細胞の増殖や機能維持に関わるとされている神経栄養因子に着目し、ラット肝の重量増加(肝細胞増殖)と神経栄養因子やその受容体の遺伝子発現との関連性についても検討を加えた。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
グルココルチコイド(GC)は、糖代謝のみならずストレスや中枢神経系機能の調節に深く関わっている。そこで、生活環境中のGC様活性物質の検索を行った。なお、本研究では種々の食用植物や生薬のメタノールエキスを試料とし、測定には昨年度開発したルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いた。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
ラット肝初代培養細胞より樹立した培養肝細胞株を用いて各種P450分子種の発現・誘導能をRT-PCR法を用いて検討し、その有用性を調べた。
4)P450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
上記in vitro毒性評価系の確立を目指すとともに、ディーゼル排気粉塵抽出物のP450発現に及ぼす影響とそれらの代謝的活性化について検討した。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)をP450誘導剤で処理したラット肝ミクロソームおよびヒトP450を用いてin vitroで代謝させ、その活性や特徴を検討した。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
non-planar PCBの2,2',4',5,5'-ペンタクロロビフェニール(PentaCB: CB101)や2,2',3',4',5,6-ヘキサクロロビフェニール(HexaCB: CB132)の他、これら化合物を含むKC500を試料として、ラットとマウスに投与し、種々臓器重量の変動や、肝チトクロームP450(P450 と略す)などの薬物代謝酵素の発現変動を測定するとともに、精巣でのアンドロゲン生合成酵素遺伝子発現への影響をRT-PCR法を用いて検討した。また同時に、血中の甲状腺ホルモン(T4)量やテストステロン量を測定し、薬物代謝酵素の発現変動との関連性を追究した。また同様に、精巣におけるアンドロゲン生合成阻害や肝増殖作用がある鉛イオン(硝酸鉛)をラットやマウスに投与し、肝や精巣における薬物やステロイドホルモンの代謝に関わる酵素(P450分子種:CYP1A1/2, 3A1/3A2など)や ステロイドホルモン生合成に関わる酵素(HMG-CoA reductase、CYP51、CYP11, CYP17など)の遺伝子発現をRT-PCR法を用いて比較検討した。さらに、神経細胞のみならず血管平滑筋細胞の増殖や機能維持に関わるとされている神経栄養因子に着目し、ラット肝の重量増加(肝細胞増殖)と神経栄養因子やその受容体の遺伝子発現との関連性についても検討を加えた。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
グルココルチコイド(GC)は、糖代謝のみならずストレスや中枢神経系機能の調節に深く関わっている。そこで、生活環境中のGC様活性物質の検索を行った。なお、本研究では種々の食用植物や生薬のメタノールエキスを試料とし、測定には昨年度開発したルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いた。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
ラット肝初代培養細胞より樹立した培養肝細胞株を用いて各種P450分子種の発現・誘導能をRT-PCR法を用いて検討し、その有用性を調べた。
4)P450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
上記in vitro毒性評価系の確立を目指すとともに、ディーゼル排気粉塵抽出物のP450発現に及ぼす影響とそれらの代謝的活性化について検討した。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)をP450誘導剤で処理したラット肝ミクロソームおよびヒトP450を用いてin vitroで代謝させ、その活性や特徴を検討した。
結果と考察
以下、研究項目別に結果、考察を加える。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
PCB(PentaCB、HexaCBやKC500)あるいは硝酸鉛をラットやマウスに投与した場合の肝臓および精巣の臓器重量への影響や、各臓器におけるステロイドホルモンの合成・分解に関わる酵素の影響を比較検討し、それぞれ臓器差や種差があることを示した。また、ラット、マウス間でみられるPCB類投与時における各活性代謝物量や血中T4量の相違は、今回調べた酵素の遺伝子(mRNA)発現量の差とは必ずしも一致しないことが明らかとなった。一方、PentaCB、HexaCBの代謝的活性化に関わる酵素蛋白量あるいは比活性と各活性代謝物の生成量や毒性発現には密接な関連性が示唆され、mRNAから酵素蛋白質への翻訳効率や動物種間における同種酵素の比活性の相違が、活性代謝物生成や毒性発現に種差や臓器差を生む要因になると推測された。しかし、肝外臓器の酵素活性測定は酵素量が少なく困難な場合が多いことや、酵素の発現誘導機序に関する種差や臓器差の解析を考えると、mRNAレベルでの研究は不可欠である。なお、本研究で、KC500にはマウス選択的に血中テストステロン量を増加させる作用があることや、肝重量の増加に神経栄養因子が関与している可能性を世界に先駆け見出したことは特筆に値する。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
昨年度確立したGC様作用物質のルシフェラーゼアッセイ法を用いて生薬カミツレ中からGC様作用成分として4種の化合物を同定し、そのうち3種がフラボノイドであることを明らかにした。また、ダイズ、ニンジン、ピーマン、ダイコンなど50種の食用植物のメタノール抽出物についてGC様作用物質の検索を行ったが、これら食用植物からはGC様作用物質は検出されなかった。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
樹立したラット肝培養細胞株(Kan-R1およびKan-R2細胞株)は、その細胞の大きさや軟寒天培地での増殖性等の点で性質は異なるが、いずれも種々P450を定常的に発現しており、これら細胞株が種々のP450発現制御機構の解明に有用であることが確認された。
4)チトクロームP450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
標記in vitro毒性評価系の構築を試みているが、未だその実用化には至っていない。一方、昨年度より並行して進めてきたディーゼル排気粉塵抽出物中のニトロ化合物について、代謝的活性化に関わる酵素やその誘導能について検討を加え、これらニトロ化合物には自身の代謝活性化に関わるP450分子種(特にCYP1B1)を肺、肝臓、腎臓などに誘導する性質があることを明らかにした。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
ヒトおよび種々系統ラットの肝ミクロソーム(P450酵素)を用いて、TCDDのin vitro代謝における種差・性差を比較検討し、ラット系統差やヒト、ラット間での種差を見出した。また、本反応は補酵素としてNADPHを必要とするが、一酸化炭素で完全には阻害されないため、P450以外の酵素の関与も考えられた。この点に関してはさらに検討を行う必要がある。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
PCB(PentaCB、HexaCBやKC500)あるいは硝酸鉛をラットやマウスに投与した場合の肝臓および精巣の臓器重量への影響や、各臓器におけるステロイドホルモンの合成・分解に関わる酵素の影響を比較検討し、それぞれ臓器差や種差があることを示した。また、ラット、マウス間でみられるPCB類投与時における各活性代謝物量や血中T4量の相違は、今回調べた酵素の遺伝子(mRNA)発現量の差とは必ずしも一致しないことが明らかとなった。一方、PentaCB、HexaCBの代謝的活性化に関わる酵素蛋白量あるいは比活性と各活性代謝物の生成量や毒性発現には密接な関連性が示唆され、mRNAから酵素蛋白質への翻訳効率や動物種間における同種酵素の比活性の相違が、活性代謝物生成や毒性発現に種差や臓器差を生む要因になると推測された。しかし、肝外臓器の酵素活性測定は酵素量が少なく困難な場合が多いことや、酵素の発現誘導機序に関する種差や臓器差の解析を考えると、mRNAレベルでの研究は不可欠である。なお、本研究で、KC500にはマウス選択的に血中テストステロン量を増加させる作用があることや、肝重量の増加に神経栄養因子が関与している可能性を世界に先駆け見出したことは特筆に値する。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
昨年度確立したGC様作用物質のルシフェラーゼアッセイ法を用いて生薬カミツレ中からGC様作用成分として4種の化合物を同定し、そのうち3種がフラボノイドであることを明らかにした。また、ダイズ、ニンジン、ピーマン、ダイコンなど50種の食用植物のメタノール抽出物についてGC様作用物質の検索を行ったが、これら食用植物からはGC様作用物質は検出されなかった。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
樹立したラット肝培養細胞株(Kan-R1およびKan-R2細胞株)は、その細胞の大きさや軟寒天培地での増殖性等の点で性質は異なるが、いずれも種々P450を定常的に発現しており、これら細胞株が種々のP450発現制御機構の解明に有用であることが確認された。
4)チトクロームP450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
標記in vitro毒性評価系の構築を試みているが、未だその実用化には至っていない。一方、昨年度より並行して進めてきたディーゼル排気粉塵抽出物中のニトロ化合物について、代謝的活性化に関わる酵素やその誘導能について検討を加え、これらニトロ化合物には自身の代謝活性化に関わるP450分子種(特にCYP1B1)を肺、肝臓、腎臓などに誘導する性質があることを明らかにした。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
ヒトおよび種々系統ラットの肝ミクロソーム(P450酵素)を用いて、TCDDのin vitro代謝における種差・性差を比較検討し、ラット系統差やヒト、ラット間での種差を見出した。また、本反応は補酵素としてNADPHを必要とするが、一酸化炭素で完全には阻害されないため、P450以外の酵素の関与も考えられた。この点に関してはさらに検討を行う必要がある。
結論
本年度の代表的な研究成果として、1)PCB類(PentaCB、HexaCBやKC500)や重金属イオン類(硝酸鉛)をマウスやラットに投与した場合、内分泌かく乱物質の代謝パターンやホルモン合成・分解に関わるP450酵素の発現には、それぞれ動物種差や臓器(肝臓と精巣)差があることを再確認したこと、また、2)いずれのPCBを投与した場合にも、ラットとマウスいずれの動物でも血中T4量が低下し、さらに、KC500投与時にはマウス選択的に血中テストステロン量が増加すること、3)TCDDの代謝に関わる肝酵素の比活性にはラット系統差や動物種差などがあること、さらに、4)内分泌かく乱物質投与により重量が増加した肝では神経栄養因子やその受容体遺伝子の発現が上昇することなどの新知見を得たことが挙げられる。上記結果は、内分泌かく乱物質に対する感受性の動物種差が、期待通り内分泌かく乱物質曝露時のP450酵素の発現変動の種差と深く関わっていることを示唆しており、初期実験計画に沿った研究の重要性が再確認された。さらに、内分泌かく乱物質による臓器重量の変化には神経栄養因子が関与する可能性を見出し、神経栄養因子の発現を指標とした解析の必要性も提示した。また、今回用いた50種の食用植物からはGC様作用物質は検出されなかったが、ヒト健康影響を考えると生活関連物質からのGC様作用物質の継続的検索も必要である。
公開日・更新日
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