化学物質の有害性評価手法の迅速化、高度化に関する研究－新型反復暴露実験と単回暴露実験の網羅的定量的遺伝子発現情報の対比による毒性予測の精緻化と実用版毒性予測評価システムの構築－

文献情報

文献番号

201524018A

報告書区分

総括

研究課題名

化学物質の有害性評価手法の迅速化、高度化に関する研究－新型反復暴露実験と単回暴露実験の網羅的定量的遺伝子発現情報の対比による毒性予測の精緻化と実用版毒性予測評価システムの構築－

課題番号

H27-化学-指定-001

研究年度

平成27(2015)年度

研究代表者(所属機関)

菅野　純(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部)

研究分担者(所属機関)

北野　宏明(特定非営利活動法人システム・バイオロジー研究機構)
北嶋　聡(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部 )
相崎　健一(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部 )

研究区分

厚生労働科学研究費補助金健康安全確保総合研究分野化学物質リスク研究

研究開始年度

平成27(2015)年度

研究終了予定年度

平成29(2017)年度

研究費

28,198,000円

研究者交替、所属機関変更

-

研究報告書（概要版）

研究目的

化学物質が生体に及ぼす毒性影響の評価手法を、生体反応の分子メカニズムに基いて迅速化、高精度化、省動物化し、インフォマティクス技術と統合して実用化する事を目的とする。
先行研究にて構築済みの延べ6.5億遺伝子情報からなる高精度トキシコゲノミクスデータベースと単回暴露時の毒性ネットワーク解析技術を基盤に、これらを維持・拡充しつつ、反復暴露のネットワーク解析、及び、その予測評価技術を開発する。ここにインフォマティクス専門家によるシステムトキシコロジーの概念を導入し、反復暴露にも対応する網羅的毒性予測評価システムの構築を進める。

研究方法

我々が開発したPercellome絶対量化法(BMC Genomics.7,64,2006/特許441507/細胞１個当たりのmRNAコピー数として発現値を得る方法)を用いて化学物質の反復暴露に対する生体の遺伝子発現の反応を解析した結果、毎回の投与の度に、①その都度の変化を示す「過渡反応」と、②回を重ねるに連れて発現値の基線（ベースライン）が徐々に移動する「基線反応」の二つの成分から構成され、単回暴露影響を単純に積算した変化とは異なることが明らかとなった。具体的には、過渡反応と基線反応の関連性が観測可能な新型反復暴露実験（4日間の反復暴露を行い、次の日に従来通りの単回暴露を実施し2、4、8、24時間後に肝の網羅的遺伝子解析を行う）を、飼育環境を厳密に管理して実施した（国立医薬品食品衛生研究所の「動物実験の適正な実施に関する規程」を遵守）。
また、先行研究で新型反復暴露実験を実施した化学物質を中心に、DNAメチル化解析及びノンコーディングRNA解析を、次世代シークエンサを用いて行った。
なお本研究解析に用いるアルゴリズムは、Percellome技術やシステムバイオロジーに基づいて開発し、独自開発の解析プログラムに実装の上、利用した。

結果と考察

反復暴露については、解熱鎮痛薬であるアセトアミノフェン及び抗てんかん薬であるフェノバルビタールの新型反復暴露実験を実施した。前者は、基本的に先行研究と同様に、単回暴露時の過渡反応成分と反復暴露時の基線反応成分の基本的な関連性を確認し、加えて化学物質特有の所見として、反復暴露により過渡反応が増強する遺伝子が多い傾向を認めた。この特徴と反復暴露による肝障害の誘発との関連が注目された。後者も、基本的に前者と同様の傾向を示し、反復暴露の分子基盤に小胞体ストレスが存在していた。尚、特有の所見として初期にPXR/SXR、CARのシグナルネットワークが発動すると共に、細胞増殖、修復、アポトーシス関連のシグナルの増幅が示唆された。
化学物質の反復暴露による基線反応成立のエピジェネティクス機構解析においては、Methyl-Seq DNA Library Kitを利用する次世代シーケンサーを用いた解析手法の性能評価と最適化を行い、DNAメチル化状態の網羅的解析プロトコルを確立した。
化学物質の反復暴露におけるノンコーディングRNAの発現解析については、Percellome適用を含む測定基盤の整備をほぼ終えた。
システムトキシコロジー解析技術の基盤整備及び応用開発においては、複雑な毒性機序の解析に対応するensemble learning systemの開発を行い、所定の性能を有することを確認した。また既存の解析ソフトウェアの機能強化とGaruda準拠による他ソフトウェアとの連動性強化を実施し、毒性解析パイプラインの構築に向け、大きく進展した。
Percellome専用解析ソフトウェアのオンライン化促進については、権利や利用ライセンス関係の整理を進めたことで、より幅広い分野から利用されるようになり、安全性評価技術の普及による国民生活の安全性確保の強化が期待される。

結論

新型反復暴露解析では、先行研究と同様に、過渡反応と基線反応の基本的な関連性を見いだした。この知見は新規性が高く、エピジェネティクス機序の関与が示唆され、この解明が反復毒性の分子毒性学的理解の促進、及び、単回暴露データからの反復毒性の予測法の開発が期待される。
反復暴露による基線反応成立のエピジェネティクス機構解析及びノンコーディングRNAの発現解析について、網羅的なデータを安定して得るプロトコルの作成・最適化を達成した。平成28年度からは、四塩化炭素などを反復投与した際の肝サンプルを解析し、反復暴露による基線反応成立等への関与を検討する。
システムトキシコロジー解析技術の基盤整備及び応用開発についてもensemble learning systemを基盤にプロジェクトの最終目標の達成、即ち毒性解析パイプラインの構築を進める。
Percellome専用解析ソフトウェアのオンライン化促進においても、引き続き研究成果の速やかな社会還元を推進する。