個体の成長期における毒性メカニズムに基づく新規in vitro発達神経毒性評価法に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201524002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 個体の成長期における毒性メカニズムに基づく新規in vitro発達神経毒性評価法に関する研究
• 課題番号: H25-化学-一般-002
• 研究年度: 平成27(2015)年度
• 研究代表者(所属機関): 諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部第二室)

研究分担者(所属機関)

• 宇佐見　誠(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部)
• 佐藤　薫(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部)
• 関野　祐子(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部 )
• 上野　晋(産業医科大学　産業生態科学研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成25(2013)年度
• 研究終了予定年度: 平成27(2015)年度
• 研究費: 23,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年、自閉症など発達障害が急速に増加し社会問題となっている。その原因の一つは発達期における化学物質の曝露とされる。発達期の神経系は成体より化学物質に対する感受性が高く、健康被害が長期間あるいは遅発性に生じることが考えられるため、子どもの影響評価法の確立が強く望まれる。現在、OECDやEPAによって、妊娠ラットを用いる発達神経毒性試験ガイドラインが制定されているが、試験方法が複雑で、試験期間は1年以上、動物数は720にも及び経費も膨大である。さらに、日本ではこのようなガイドラインは未整備である。そこで我々は、現行ガイドラインの欠点を克服し、簡便かつ低コストのin vitro評価系として、各発達期における神経系の毒性評価法、遅発性の神経回路異常による毒性評価法の基盤を開発している。昨年度までに、遅発性神経毒性が懸念されるバルプロ酸および発生毒性が懸念される内分泌かく乱物質リブチルスズを研究班で共通の化合物として用いて、各発達段階における神経毒性を明らかにした。本年度は、発達神経毒性を有する有機リン系農薬クロルピリホスを共通の化合物として新たに検証した。

研究方法

遅発性の神経毒性が懸念されるクロルピリホスを研究班共通の化合物として追加し、当初の計画に従って、我々が独自に構築した各発達段階におけるin vitro神経毒性評価を行った。特に、我々が開発した各発達期における評価方法にもとづいて、in vitroの系として、ヒト未分化細胞の代謝、神経堤細胞の遊走、発達成長期神経系細胞新生の評価を行った。また、遅発性の毒性評価方法である生後や幼若期神経回路の機能をスライス切片を用いて検討した。

結果と考察

幹細胞から生後・幼若期までの各発達段階において、有機リン系農薬クロルピリホスの神経毒性作用を検出できることを明らかにした。各発達時期の評価結果は以下の通りである。
【①ヒト未分化細胞の代謝】クロルピリホスによりヒト幹細胞のエネルギー代謝異常を見出した。とくに、化学物質によりミトコンドリア形態制御機構が阻害されATP産生が抑制されることにより増殖が抑制される新規の毒性発現メカニズムを明らかにした。
【②神経堤細胞の遊走】ラット神経堤細胞遊走実験法により、培養48 時間までは50uMまでは神経堤細胞の遊走促進傾向が認められた。培養48から72時間では、最低濃度の6.25uM以上で抑制傾向が認められた。従って、クロルピリホスは神経堤細胞の遊走に対して複数のメカニズムを介して影響を及ぼすと考えられた。
【③発達成長期神経系細胞新生】前脳矢状切片の脳室下帯に存在する神経幹細胞および前駆細胞を蛍光標識し切片培養を行い、評価化合物を適用し定量的な評価を行った。クロルピリホスは、新生神経系細胞数減少、新生オリゴデンドロサイト数の減少を引き起こすことを明らかにした。
【④生後神経回路】クロルピリホスはバルプロ酸同様な変化が観察され、過剰な脳回の形成も認められた。
【⑤幼若期神経回路】クロルピリホスは、VPA胎生期曝露の場合に認められた興奮性神経回路の発達が亢進する傾向が認められた。

結論

本研究において、バルプロ酸、有機スズに加えて、有機リン系農薬クロルピリホスを新たに追加して、作用機序の異なる陽性対照物質に対して幹細胞から生後・幼若期までの毒性を検出することができた。これにより発達神経毒性の各試験法を組み合わせた統合的な評価が可能になることが期待される。今後、本評価法の予測性などを国際的に検証し、試験法として確立させる必要がある。特に、HESIのNeuroTOXと連携を図りながら、簡便かつ再現性の高いプロトコルの整備を進める。既に上記の3化合物を含めた検証化合物などの情報を共有しており、引き続き試験法としての有用性等を議論する予定である。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-28
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201524002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 個体の成長期における毒性メカニズムに基づく新規in vitro発達神経毒性評価法に関する研究
• 課題番号: H25-化学-一般-002
• 研究年度: 平成27(2015)年度
• 研究代表者(所属機関): 諫田 泰成(国立医薬品食品衛生研究所 薬理部第二室)

研究分担者(所属機関)

• 宇佐見　誠(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部 )
• 佐藤　薫(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部 )
• 関野　祐子(国立医薬品食品衛生研究所　薬理部 )
• 上野　晋(産業医科大学　産業生態科学研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成25(2013)年度
• 研究終了予定年度: 平成27(2015)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

近年、自閉症など発達障害が急速に増加し社会問題となっている。その原因の一つは発達期における化学物質の曝露とされる。発達期の神経系は成体より化学物質に対する感受性が高く、健康被害が長期間あるいは遅発性に生じることが考えられるため、子どもの影響評価法の確立が強く望まれる。現在、OECDやEPAによって、妊娠ラットを用いる発達神経毒性試験ガイドラインが制定されているが、試験方法が複雑で、試験期間は1年以上、動物数は720にも及び経費も膨大である。さらに、日本ではこのようなガイドラインは未整備である。そこで我々は、現行ガイドラインの欠点を克服し、簡便かつ低コストのin vitro評価系として、神経系の発達評価法、胎児期曝露による遅発性の神経回路異常による毒性評価法の基盤を開発している。発達期の中枢神経系は成体組織より化学物質に対する感受性が高く、健康被害が長期間あるいは遅発性に生じることが懸念される。すでに我々は平成 22～24 年度の化学物質リスク事業「個体の成長期における神経系および肝臓系細胞の機能解析による化学物質の健康影響評価法に関する研究」において、各発達段階における評価系を構築した。そこで、平成 25～27 年度の本研究において、遅発性の神経毒 性が懸念されるバルプロ酸、発生毒性が懸念される内分泌かく乱物質トリブチルスズ、有機リン系農薬で神経毒性作用を有するクロルピリホスを研究班共通の化学物質として使用し、当初の計画に従って、我々が独自に構築した「胎生・神経発達期」から「成熟期」までの各発達段階において、in vitro神経毒性評価を行った。

研究方法

発生毒性が懸念される陽性対照化合物として、遅発性神経毒性が懸念されるバルプロ酸、内分泌かく乱物質トリブチルスズ、有機リン系農薬クロルピリホスの3種類の化合物を選択して、胎生・神経発達期および成熟期（神経回路形成期）において検証した。

結果と考察

本研究において、発達毒性が懸念される陽性対照化合物としてバルプロ酸およびトリブチルスズ、クロルピリホスを用いて、幹細胞から生後・幼若期までの毒性を評価した。バルプロ酸、トリブチルスズ、クロルピリホスはいずれもヒト幹細胞において毒性が認められた。バルプロ酸、トリブチルスズについては妊娠動物の投与により生後早期の海馬神経回路に異常をきたすことから、我々が開発した各発達期における毒性評価系の有用性を示すことができた。特に興味深いことに、ヒト多能性幹細胞、胎児期の神経堤細胞、生後初期の神経・グリア細胞を用いた神経新生を指標とするin vitro評価系において、いずれの段階でもVPAによる亢進、TBTによる抑制がみられた点があげられる。in vivoとin vitro評価系の結果と同じ方向性であることから、幹細胞の異常が早期の神経回路に影響を与える可能性が示唆される。この結果は、高次機能の予測にin vitroの系が有用であると考えられ、さらなるメカニズムの検討が必要である。クロルピリホスはin vitro評価では抑制の方向に作用しているが、in vivoの作用は現在検討中であり、パラレルな挙動を示すのか興味深い。さらに、それぞれのエンドポイントにおいて個々の発達期に選択的な毒性発現メカニズムも明らかにすることができた。したがって、上記の方法を毒性メカニズムに基づき、各発達時期に応じた試験法を組み合わせることにより統合的な評価法が有用であることが示された。

結論

我々が構築した各発達期の神経毒性評価を用いて、発達毒性を有する化学物質の中から作用の異なるバルプロ酸、トリブチルスズ、クロルピリホスの神経毒性を明らかにした。特に、胎生期として発達過程に対応した培養標本による評価法、成熟期として脳切片標本によるシナプス機能影響評価法の確立を確立した。
今後、既存毒性データとの比較などにより、評価系の有用性・予測性を検証することにより、国内外の評価法/試験法として発展させることを目指している。とくに、HESIのNeuroTOXと国際的な連携を図りながら、プロトコルの整備を進め、国際的な評価系へと発展させることを考えており、すでに化学物質の情報やプロトコルを共有しており、予測性などの検証を進めている。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-28
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201524002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 発達期の神経系は成体より化学物質に対する感受性が高く、健康被害が長期間あるいは遅発性に生じるため、簡便でスループット性の高い子どもの影響評価法の確立が望まれる。本研究では、発生毒性が懸念される陽性対照化合物として、バルプロ酸、トリブチルスズ、クロルピリホスを選択して、胎生期および成熟期において検証した。その結果、作用機序の異なる化学物質に関して、幹細胞から生後神経回路にいたるまでの発達神経毒性を評価できることを明らかにした。従って、発達時期に応じて統合的な評価法が有用であると示唆された。
• 臨床的観点からの成果: 近年、自閉症など発達障害が急速に増加し社会問題となっている。その原因の一つは発達期における化学物質の曝露とされる。胎生期として発達過程に対応した培養標本による評価法、成熟期として脳切片標本によるシナプス機能影響評価法により発達毒性が懸念される陽性対照化合物の毒性を検出することができた。従って、発達段階に応じた評価系の有用性を明らかにした。
• ガイドライン等の開発: 現在、OECDでインビトロ発達神経毒性ガイダンス案の作成が進められており、専門委員としてガイダンスの作製に貢献する。
• その他行政的観点からの成果: 今後、さらに化合物を追加して、既存毒性データとの比較などにより、 評価系の有用性・予測性を検証する予定である。将来的には、OECDのAOPや新規試験法として提案することにより、国内外の化学物質の管理など行政に活用できるようにしたい。
• その他のインパクト: 本成果の一部は、日本毒性学会田邊賞ならびに第3回メタロミクス研究フォーラム若手奨励賞を受賞した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 8件
• 原著論文（英文等）: 40件
• その他論文(和文): 2件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 185件
• 学会発表(国際学会等): 35件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Asanagi M, Yamada S, Hirata N et al.; Tributyltin induces G2/M cell cycle arrest via NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase in human embryonic carcinoma cells.; J Toxicol Sci , 41 (2) , 207-215 (2016); 10.2131/jts.41.207
• 原著論文2: Hirata N, Yamada S, Asanagi M et al.; Nicotine induces mitochondrial fission through mitofusin degradation in human multipotent embryonic carcinoma cells. ; Biochem Biophys Res Commun , 470 (2) , 300-305 (2016); 10.1016/j.bbrc.2016.01.063
• 原著論文3: Yamada S, Kotake Y, Nakano M et al.; Tributyltin induces mitochondrial fission through NAD-IDH dependent mitofusin degradation in human embryonic carcinoma cells; Metallomics , 7 (8) , 1240-1246 (2016); 10.1039/c5mt00033e
• 原著論文4: Yamada S, Kotake Y, Demizu Y et al.; NAD-dependent isocitrate dehydrogenase as a novel target of tributyltin in human embryonic carcinoma cells; Sci Rep , 4 , 5952- (2014); 10.1038/srep05952
• 原著論文5: Yamada S, Kotake Y, Sekino Y et al.; “AMP-activated protein kinase-mediated glucose transport as a novel target of tributyltin in human embryonic carcinoma cells; Metallomics , 5 (5) , 484-491 (2013); 10.1039/c3mt20268b
• 原著論文6: Usami M, Mitsunaga K, Irie T et al.; Proteomic analysis of ethanol-induced embryotoxicity in cultured post-implantation rat embryos.; J Toxicol Sci , 39 (2) , 285-292 (2014); 10.2131/jts.39.285
• 原著論文7: Usami M, Mitsunaga K, Irie T et al.; Various definitions of reproductive indices: a proposal for combined use of brief definitions; Congenit Anom (Kyoto) , 54 (1) , 67-68 (2014); 10.1111/cga.12036
• 原著論文8: Kim SR, Kubo T, Kuroda Y et al.; Comparative metabolome analysis of cultured fetal and adult hepatocytes in humans; J Toxicol Sci , 39 (5) , 717-723 (2014); 10.2131/jts.39.717
• 原著論文9: Usami M, Mitsunaga K, Irie T et al.; Simple in vitro migration assay for neural crest cells and the opposite effects of all-trans-retinoic acid on cephalic- and trunk-derived cells; Congenit Anom (Kyoto) , 54 (3) , 184-188 (2014); 10.1111/cga.12059
• 原著論文10: Usami M, Mitsunaga K, Miyajima A et al.; Effects of 13 developmentally toxic chemicals on the migration of rat cephalic neural crest cels in vitro; Congenit Anom (Kyoto) , 56 (2) , 52-59 (2016); 10.1111/cga.12121

公開日・更新日

• 公開日: 2023-04-28
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201524002Z
• 報告年月日: 2016年05月23日

収入

• (1)補助金交付額: 23,000,000円
• (2)補助金確定額: 22,691,555円
• 差引額 [(1)-(2)]: 308,445円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	11,545,437円
		人件費・謝金	3,759,052円
		旅費	2,102,246円
		その他	5,288,263円
	間接経費		0円
	合計		22,694,998円

備考

備考

平成27年度報告書および3年間の総合報告書の印刷費が予想以上に安かったため、残高が発生した。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-28
• 更新日: -