ＰＣＳＫ９をターゲットとした核酸医薬の薬事申請を目指した治験に橋渡しするための非臨床試験

文献情報

• 文献番号: 201435003A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ＰＣＳＫ９をターゲットとした核酸医薬の薬事申請を目指した治験に橋渡しするための非臨床試験
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 斯波 真理子(独立行政法人国立循環器病研究センター 病態代謝部)

研究分担者(所属機関)

• 小比賀　聡(大阪大学大学院薬学研究科)
• 小林　直之(大阪大学大学院薬学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【委託費】 医療技術実用化総合研究（臨床研究・治験推進研究事業）
• 研究開始年度: 平成26(2014)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 42,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　家族性高コレステロール血症（FH）は、高LDLコレステロール(LDL-C)血症、皮膚および腱黄色腫、若年性動脈硬化症による冠動脈疾患を主徴とする遺伝病であり、ヘテロ接合体は500人に1人以上の頻度で認められる。冠動脈疾患の一次予防や二次予防のために、多くのFHヘテロ接合体においてはスタチンを含む複数の脂質低下薬が処方されている。しかしながら、目標LDL-C値に達する例は少ない。スタチンや脂質低下薬は、SREBP2を活性化してLDL受容体活性を上昇するため、同時にLDL受容体分解活性を持つPCSK9発現を上昇することが大きな原因と考えられている。PCSK9は、そのプロドメインが活性部位を覆う形で存在するため、低分子阻害薬で阻害することが困難であることが創薬を困難にしている。
　本研究は、小比賀らのオリジナルである人工核酸修飾技術を用いて、家族性高コレステロール血症を始めとする難治性高コレステロール血症の治療を行うものであり、日本発の技術を世界に示すことができる。本研究においては、これまでに最適化されたPCSK9をターゲットとしたBNA修飾ASを動物に投与する非臨床試験および品質保証計画立案の実施を行う。遺伝毒性試験、急性毒性試験、反復投与毒性試験、安全性薬理試験を行い、薬事申請を目指した治験に橋渡しするための非臨床試験を実施し、研究終了後の臨床試験に備える。

研究方法

目標とする臨床の前期第Ⅱ相試験（PⅡa）の試験デザインの概要を基に、FIHとなる臨床第Ⅰ相試験（PⅠ）の試験デザインを作成した。AmNAのアミダイト体（A, G, C, Tの４種）について、紫外吸収（260 nm）を指標とした逆相HPLCによる分析を実施し、その純度を評価した。各AmNAアミダイト体について31P-NMR測定を実施し、その構造並びに純度情報を収集した。1H-NMR測定を行い、リン原子を含まない夾雑物の検出の可否について検討を行った。本被験物質のターゲット遺伝子がヒトと同じ配列を有するカニクイザルを選択し、2〜6歳の雌雄計28匹を用意し、馴化終了日に、トリグリセリド（TG）あるいはLDL-Cの高い動物を選別し、試験に供給した｡HELSA法を用いて、ASOの測定系を確立し、GLP適合施設への、移管を行った後、バリデーションを実施するものとした。これらの品質保証および非臨床試験のデザインは、PMDAの薬事戦略相談を受け、内容を反映させながら行う。

結果と考察

　AmNAアミダイト体の純度を精査するために、逆相HPLCによる分析を実施した。今回ジアステレオマーは一般的な逆相HPLC条件下で分離可能であった。今回分析を行ったAmNAアミダイト体は、いずれも比較的純度が高く今回の逆相HPLC分析では、いずれも96%以上の純度を示した。AmNAアミダイト体の31P-NMR分析を実施し、４種のAmNAアミダイト体について、逆相HPLC分析での結果と良い一致を示した。
　非臨床試験に用いる被験物質は、分析データを取得した上で製造法の検討中に得られるサンプルを被験物質として用いる可能性を考慮し、GLP適合試験に供するための暫定的な製造方法及び暫定規格を設定することとした。
　薬効試験では、カニクイザル雌雄計28匹からLDL-Cの高い動物4匹（雄2匹，雌２匹）を用いて実験を開始した。初回の1 mg/kgを投与し、投与量は漸増していく予定である。一般状態観察、体重、摂餌量及び投与後6日までの血液生化学検査の結果から薬効或は毒性症状を判断し決定する予定である。
ASの定量には、ELISA（HELISA）法を用い、AS を段階希釈し、マウス肝臓由来のタンパク質を一定量加え、HELISA法を用いて、蛍光強度を測定し、真度と精度を求め、良好であることを確認した。また、HELISA法の選択性について検証すべく、16塩基長のアンチセンス分子を基準として20、10塩基長のものを用意した。濃度の高い領域においてより選択的に16塩基長の検出が可能であることが示された。

結論

　アンチセンス分子の臨床試験に橋渡しをするための非臨床安全性試験の実施戦略を作成するとともに、臨床応用を見据えた品質管理法の戦略を立案した。品質保証に関しては、逆相HPLC、31P-NMR、1H-NMRによる分析を実施し、それぞれの分析手法の有効性、適用範囲等について検証を行った。定量法の構築や、安全性の担保できる開発候補を選定し、現在は、非げっ歯類としてアカゲザルへの投与実験を遂行している。定量法に関してはHELISA法の構築と定量法としての評価を行い、良好な結果が得られたことから、GLP施設への技術移管を既に実施している。PMDA対面助言を終え、研究は順調に進捗している。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201435003C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: PCSK9をターゲットとした新規核酸医薬の臨床化に向けて、非臨床試験および品質を行うことを目的とした研究であり、本年度はげっ歯類による毒性検討試験および分析法のバリデーションを実施し、三種の候補のうち１種の開発候補および１種のバックアップ配列を選定した。核酸医薬の原薬となる人工核酸搭載型オリゴヌクレオチドの製造における原料（アミダイト体）の品質検証に関する研究を行った。また、PMDA薬事戦略相談の対面助言の結果を受け、非臨床試験の実施戦略を作成し、次年度以降の研究の基礎を構築した。
• 臨床的観点からの成果: 本研究は、PCSK9をターゲットとして、架橋型人工核酸（BNA）を用いて、難治性高コレステロール血症に対する新しい治療法を開発するものである。現在、多くの脂質低下薬を極量服用しても目標LDL-C値まで低下せず心筋梗塞を繰り返している患者や、LDLアフェレシス治療を余儀なくされている患者に対して、１か月に１回の皮下注射により良好にLDL-C値をコントロールすることが期待でき、CADの予防だけでなく動脈硬化症の退縮をも期待できる、すなわち、今までにない画期的な薬剤を臨床応用することができる。
• ガイドライン等の開発: 本研究プロジェクトは、革新的医薬品医療機器再生医療実用化促進事業の中の医薬品分野、「核酸医薬の臨床有効性、安全性の評価方法」のモデルケースに選ばれており、大阪大学薬学研究科、大阪大学医学系研究科、国立循環器病研究センター研究所医薬品食品衛生研究所、PMDA、医薬基盤研究所との共同研究により、高コレステロール血症等を対象とした核酸医薬の臨床開発を通じて、核酸医薬の安全性・有効性の評価方法について検討を行い、核酸医薬の実用化のガイドライン作成を行なった。
• その他行政的観点からの成果: 本研究プロジェクトが対象としている患者は、家族性高コレステロール血症(FH)の中でも重症で、LDL受容体、PCSK9などに複数の変異を有している患者であり、ホモ接合体に分類される。FHホモ接合体は、特定疾患研究事業の対象疾患の1つであり、脂質低下薬を極量服用し、LDLアフェレシスを行っても、動脈硬化の進行を止めることが困難な病気である。本研究により、PCSK9をターゲットとした薬剤の開発が成功すれば、これらの患者に対して顕著に効果を有する薬剤となりうる。
• その他のインパクト: 2016年9月、家族性高コレステロール血症・アフェレーシス患者会10周年イベントにて、新しい薬剤開発の状況について、発表。2017年2月、日本アフェレシス学会関西地方会市民公開講座において、コレステロールの功罪、制御法について発表。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 20件
• その他論文(和文): 15件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 25件
• 学会発表(国際学会等): 10件
• その他成果(特許の出願): 2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 10件 ; 家族性高コレステロール血症患者会における講演「新しい薬剤の開発状況」、市民公開講座における講演「コレステロールのお話」、テレビ「医のこころ」、「あさイチ」での談話など

特許

• 特許の名称: PCSK9を標的としたアンチセンス核酸
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願 2017-105121 ; 発明者名: 斯波真理子、和田郁人、小比賀聡、山本剛史他 ; 権利者名: 斯波真理子、和田郁人、小比賀聡、山本剛史他 ; 出願年月日: 20170526 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: PCSK9を標的としたアンチセンス核酸
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2018/020081 ; 発明者名: 斯波真理子、和田郁人、小比賀聡、山本剛史他 ; 権利者名: 斯波真理子、和田郁人、小比賀聡、山本剛史他 ; 出願年月日: 20180524 ; 国内外の別: 国際

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yamamoto T, Harada-Shiba M, Obika S他; Amido-bridged Nucleic Acids with Small Hydrophobic Residues Enhance Hepatic Tropism of Antisense Oligonucleotides in vivo; Org.Biomol. Chem , 13 (12) , 3757-3765 (2015)
• 原著論文2: Hori M, Ishihara M,Harada-Shiba M他; Removal of plasma mature and furin-cleaved proprotein convertase subtilisin/kexin 9 (pcsk9) by low-density lipoprotein-apheresis in familial hypercholesterolemia: Development and application of a new assay for pcsk9; J. Clin. Endocrinol. Metab , 100 (1) , 41-49 (2015); jc20143066
• 原著論文3: Ogura M, Hori M, Harada-Shiba M; Association between cholesterol efflux capacity and atherosclerotic cardiovascular disease patients with familial hypercholesterolemia; Arteriosclr Thromb Vasc Biol , 36 , 181-188 (2016)
• 原著論文4: Yamamoto T,Harada-Shiba M, Obika S他; Serial incorporation of a monovalent GalNAc phosphoramidite unit into hepatocyte-targeting antisense oligonucleotides; Bioorg Med Chem , 24 (1) , 26-32 (2016)
• 原著論文5: Wada S,Harada-Shiba M, Obika S他; Evaluation of the effects of chemically different linkers on hepatic accumulations, cell tropism and gene silencing ability of cholesterol-conjugated antisense oligonucleotides; J Controlled Release , 226 , 57-65 (2016)
• 原著論文6: Ohta N, Hori M,Harada-Shiba M他; Proprotein convertase subtilisin/kexin 9 V4I variant with LDLR mutations modifies the phenotype of familial hypercholesterolemia; J Clin Lipidol , 10 (3) , 547-555 (2016)
• 原著論文7: Wada F,Yamamoto T, Harada-Shiba M他; Cholesterol-GalNAc Dual Conjugation Strategy for Reducing Renal Distribution of Antisense Oligonucleotides.; Nucleic Acid Ther , 28 (1) , 50-57 (2018)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-16
• 更新日: 2019-06-18

収支報告書

• 文献番号: 201435003Z