ヒトへの外挿を目指したナノマテリアルの健康影響評価手法の開発

文献情報

• 文献番号: 201428004A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒトへの外挿を目指したナノマテリアルの健康影響評価手法の開発
• 課題番号: H24-化学-一般-004
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 健(東京理科大学 総合研究機構)

研究分担者(所属機関)

• 梅澤　雅和(東京理科大学　総合研究機構)
• 新海　雄介(東京理科大学　総合研究機構)
• 立花　研(日本薬科大学　薬学科)
• 菅又　昌雄(栃木臨床病理研究所)
• 井原　智美(栃木臨床病理研究所)
• 光永　総子(NPOプライメイト・アゴラ)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 14,462,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究課題は、ナノマテリアルの健康影響について特に、１）低用量曝露による次世代雄性生殖系への影響、２）次世代の免疫系・中枢神経系への影響、３）霊長類免疫系・中枢神経系に対する影響を明らかにしようとしたものである。まず、妊娠期におけるナノマテリアルの低用量曝露が次世代に及ぼす影響について、次世代の雄性生殖系機能をマーカーとしたげっ歯類の影響評価系の確立を目指した。そして、ナノマテリアルが免疫系に及ぼす影響について、ヒトに外挿できる評価系の確立を目指した。

研究方法

１）次世代雄性生殖器への影響は、母体に投与したナノ粒子の移行・蓄積ならびに精子・精巣の超微小形態の観察により評価した。２）次世代免疫系への影響は、フローサイトメトリーを用いたリンパ球組成の解析と遺伝子発現解析（機能的トランスクリプトミクスならびに定量的RT-PCR）により評価した。併せて、産仔の免疫系組織及び血液中miRNAの網羅的解析を行った。さらに、二酸化チタンナノ粒子の次世代影響標的として有力な脳において、影響発現メカニズムをエピジェネティクスの観点から明らかにするために、脳組織におけるDNAメチル化プロファイルを網羅的に解析した。３）アカゲザルを用いた研究では、新生仔の背部皮内にナノ材料としてディーゼル排気ナノ粒子（DEP）、非金属ナノ粒子（カーボンブラック：CB）、酸化金属ナノ粒子（二酸化チタン：TiO2）、蛍光ナノポリスチレン（PS）のいずれかをそれぞれ投与し、1ヶ月～3年後に投与部位、リンパ節、主要組織の試料を採取した。試料からRNAを抽出した後、遺伝子の発現変動をマイクロアレイ及び定量的RT-PCRにより解析し、その機能的特徴を明らかにした。

結果と考察

実験（１）：銀ナノ粒子の妊娠期飲水投与が次世代雄性生殖系に及ぼす影響を検証した。まず、懸濁液中の銀ナノ粒子を低濃度の塩により凝集させ、二次粒子径を大きくした（>200 nm）場合でも、次世代雄性生殖系に及ぶ影響は消失しなかった。
実験（２）：次世代免疫系（脾臓リンパ球phenotype）に対する影響発現は、一般急性毒性（気管支肺胞洗浄 BALF中細胞数増加）の生じるレベルであっても低用量で消失することが明らかになった。一方で、同用量カーボンブラックナノ粒子の妊娠後期投与は、次世代免疫系（脾臓）に対しT細胞等の細胞数を著しく増加させることが明らかになった。次世代中枢神経系に生じる影響について、ナノマテリアルのハザード分類・リスク評価に資する鋭敏かつ定量的なマーカーが得られた。ナノ粒子（カーボンブラック、二酸化チタン）を妊娠期に経気道投与すると、次世代個体の脳血管周囲の細胞（血管周囲マクロファージPVMならびにアストロサイト）が鋭敏に反応することが明らかになった。その作用の程度は、二次粒子径を同程度にしたナノマテリアルで比較した場合、カーボンブラックの方が二酸化チタンナノ粒子に比して大きかった。また、この影響は大脳皮質前頭野のGFAPタンパク質発現解析（ウェスタン・ブロット法）により定量的に分析することが可能になり、ナノマテリアルの妊娠期経気道投与が次世代中枢神経系に及ぼす影響についての用量依存性も確認することができた。ナノマテリアルの曝露によるヒト健康影響に関して、とくに次世代影響・発達毒性の考慮は、免疫系以上に中枢神経系に及ぶ影響について考慮する必要があるようである。また、ナノマテリアルの妊娠期経気道投与により次世代中枢神経系に及ぶ影響を、遺伝子発現を制御するDNAメチル化プロファイルから検証した。その結果、Pcdh9などの複数の遺伝子を標的として、プロモーター領域のDNA脱メチル化に伴う遺伝子発現亢進が認められた。
実験（３）：前述のげっ歯類のデータを踏まえ、ナノマテリアル投与がリンパ節だけでなく中枢神経系（大脳皮質前頭野、小脳、海馬）に及ぼす影響を遺伝子発現変動プロファイリングにより検証した。その結果、中枢神経系において複数のナノマテリアル・複数の脳領域に共通する変動パスウェイとして、ヘモグロビン代謝経路が見出された。

結論

本研究では、次世代中枢神経系、免疫系、雄性生殖系への影響について鋭敏かつ定量的なin vivo毒性マーカーを各々見出すことができた。一方で、発達精巣毒性をはじめとするナノマテリアルの次世代影響は、細胞への取り込みを介した直接的な細胞毒性以外によらない間接的なメカニズムが大きいようである。次には例えば、ナノマテリアルにより生じるタンパク質の高次構造変化と、それに起因する間接的生体影響評価系の構築を指向した研究が、培養細胞系もしくはcell-free systemでのナノマテリアル健康影響評価系の構築に力を発揮するであろう。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-01
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201428004B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒトへの外挿を目指したナノマテリアルの健康影響評価手法の開発
• 課題番号: H24-化学-一般-004
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 健(東京理科大学 総合研究機構)

研究分担者(所属機関)

• 梅澤　雅和(東京理科大学　総合研究機構)
• 新海　雄介(東京理科大学　総合研究機構)
• 立花　研(日本薬科大学　薬学科)
• 菅又　昌雄(栃木臨床病理研究所)
• 井原　智美(栃木臨床病理研究所)
• 光永　総子(NPOプライメイト・アゴラ)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究課題は、ナノマテリアルの健康影響について特に、１）低用量曝露による次世代雄性生殖系への影響、２）次世代の免疫系・中枢神経系への影響、３）霊長類免疫系・中枢神経系に対する影響を明らかにしようとしたものである。１）では妊娠期におけるナノマテリアルの低用量曝露が次世代に及ぼす影響について、次世代の雄性生殖系機能をマーカーとしたげっ歯類の影響評価系の確立を目指した。２）３）を通して、ナノマテリアルが免疫系に及ぼす影響について、ヒトに外挿できる霊長類及びげっ歯類の評価系を確立することを目指した。

研究方法

１）次世代雄性生殖器への影響は、母体に投与したナノ粒子の移行・蓄積ならびに精子・精巣の超微小形態の観察により評価した。２）次世代免疫系への影響は、フローサイトメトリーを用いたリンパ球組成の解析と遺伝子発現解析（機能的トランスクリプトミクスならびに定量的RT-PCR）により評価した。併せて、産仔の免疫系組織及び血液中miRNAの網羅的解析を行った。さらに、二酸化チタンナノ粒子の次世代影響標的として有力な脳において、影響発現メカニズムをエピジェネティクスの観点から明らかにするために、脳組織におけるDNAメチル化プロファイルを網羅的に解析した。３）アカゲザルを用いた研究では、新生仔の背部皮内にナノ材料としてディーゼル排気ナノ粒子（DEP）、非金属ナノ粒子（カーボンブラック：CB）、酸化金属ナノ粒子（二酸化チタン：TiO2）、蛍光ナノポリスチレン（PS）のいずれかをそれぞれ投与し、1ヶ月～3年後に投与部位、リンパ節、主要組織の試料を採取した。試料からRNAを抽出した後、遺伝子の発現変動をマイクロアレイ及び定量的RT-PCRにより解析し、その機能的特徴を明らかにした。

結果と考察

ナノマテリアルの妊娠期曝露が次世代中枢神経系に及ぼす影響は、出生後個体の脳の PAS-GFAP(IHC) 二重染色により、最も鋭敏かつ定量的に検出できることが見出された。また、大脳皮質前頭野の GFAP や　AQP4 のタンパク質発現定量解析により、発達毒性検出の定量性が確認できた。ナノマテリアルの妊娠期曝露が次世代免疫系・ならびに次世代雄性生殖系に及ぼす影響についても、それぞれ胸腺リンパ球新生に関わる遺伝子群の発現定量解析、ならびに精子産生量により各々定量的に、低濃度ナノマテリアルによる影響を検出できることを見出し報告した。新たなリスク・コミュニケーション手法も見出し、web上に公開した。
研究（１）の結果は、投与時期（出生前＝妊娠期／出生後）により銀ナノ粒子の影響する細胞種が異なる可能性を示唆している。また、銀ナノ粒子の毒性発現（とくに発達毒性）は二次粒子径に依存しなかった。ナノマテリアルの体内動態は、凝集状態が変わり二次粒子径が異なれば体内動態が異なるが、少なくとも溶解性のあるナノマテリアルについては、毒性発現プロファイルに対する体内動態の寄与がそれほど大きくない可能性がある。ナノマテリアルの毒性を考える上で、細胞への取り込みを介した直接的な細胞毒性以外によらない間接的なメカニズムの考慮が、ナノマテリアルの曝露によるヒト健康影響評価において重要であると考えられる。
研究（２）の結果は、ナノマテリアルの妊娠前期により次世代免疫系に生じる影響は、一般急性毒性の認められる用量に限られることから、ヒト健康影響防止を考える上で考慮に入れなくていいものと考えられる。ただし、ナノマテリアル曝露により次世代に生じ得る健康影響は、妊娠中の曝露時期により大きく異なる可能性があることには注意が必要である。

結論

本研究では、次世代中枢神経系、免疫系、雄性生殖系への影響について鋭敏かつ定量的なin vivo毒性マーカーを各々見出すことができた。一方で、発達精巣毒性をはじめとするナノマテリアルの次世代影響は、細胞への取り込みを介した直接的な細胞毒性以外によらない間接的なメカニズムが大きいようである。発達精巣毒性をはじめとするナノマテリアルの次世代影響は、細胞への取り込みを介した直接的な細胞毒性以外によらない間接的なメカニズムが大きいようである。次には例えば、ナノマテリアルにより生じるタンパク質の高次構造変化と、それに起因する間接的生体影響評価系の構築を指向した研究が、培養細胞系もしくはcell-free systemでのナノマテリアル健康影響評価系の構築に力を発揮するであろう。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201428004C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本研究では、次世代中枢神経系、免疫系、雄性生殖系への影響についてそれぞれ、脳血管周囲マクロファージの表現型とGFAP・AQP4タンパク質発現量、新生児期脾臓リンパ球組成、精子ならびにセルトリ細胞関連パラメーターという鋭敏かつ定量的なin vivo毒性マーカーを見出した。霊長類モデルからも機能的エンドポイント群を見出した。一方で、発達精巣毒性をはじめとするナノマテリアルの次世代影響は、細胞への取り込みを介した直接的な細胞毒性以外によらない間接的なメカニズムが大きいことが示唆された。
• 臨床的観点からの成果: とくにナノマテリアルの胎児期曝露が次世代中枢神経系に及ぼす影響について、若齢マウスにおいて老齢個体の脳に類似した慢性所見が認められた。ナノマテリアルの出生前曝露が、加齢をリスク要因とする脳神経系疾患のリスク要因になる可能性が示唆された。また、遺伝的バックグラウンドがヒトに極めて近いサルモデルのリンパ節ならびに脳において、新生児・胎児期ナノマテリアル曝露による機能的変動遺伝子群を見出した。これらは原因不明の関連疾患に対し、環境衛生学的視点からの治療標的となる可能性がある。
• ガイドライン等の開発: 厚生労働科研費補助金（化学物質リスク研究事業）では、毎年「ナノマテリアルの安全政策に係わる研究に関する研究者意見交換会を開催している。ここで研究代表者が研究内容を披露し、出席者全員と意見交換を行っている。厚労科研費評価委員、国立医薬品食品衛生研究所所長、同企画調整主幹、関係省庁職員（内閣府、経済産業省、厚生労働省）が出席している。したがって、当センターの研究内容や意見はナノマテリアルの安全政策に関わる関係省庁に伝わっており、今後、様々な審議会に間接的に反映されることが期待される。
• その他行政的観点からの成果: 本研究で示した鋭敏かつ定量的なin vivo毒性マーカーが、胎児・新生児という次代を担う高感受性集団を考慮したナノマテリアルのリスク管理スキームに適用される必要性を提起する結果を得た。
• その他のインパクト: ・2014年5月2日科学新聞（1面）「炭素ナノ粒子が次世代に影響 仔の脳血管周囲細胞に障害」; ・日本学術会議トキシコロジー分科会シンポジウム「PM2.5とナノ粒子―微小粒子の健康影響とその対策を考える―」開催（公開）; ・2014年9月19日科学新聞（1面）「シンポジウム『PM2.5とナノ粒子』開く 健康への影響と対策を議論 学術会議」

発表件数

• 原著論文（和文）: 1件
• 原著論文（英文等）: 17件
• その他論文(和文): 20件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 68件
• 学会発表(国際学会等): 50件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 3件 ; 毎年の「ナノマテリアルの安全政策に係わる研究に関する研究者意見交換会
• その他成果(普及・啓発活動): 8件 ; メディア、シンポジウム主催、共催

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Tachibana K, Umezawa M, Takeda K.etal; Prenatal diesel exhaust exposure disrupts the DNA methylation profile in the brain of mouse offspring. ; J,Toxicol,Sci. , 40 (1) , 1-11 (2015)
• 原著論文2: El-Sayed YS, Takeda K, Umezawa M.etal; Carbon black nanoparticle exposure during middle and late fetal development induces immune activation in male offspring mice.; Toxicology. , 327 , 53-61 (2015)
• 原著論文3: Shimizu R, Umezawa M, Takeda K.etal; Effect of maternal exposure to carbon black nanoparticle during early gestation on the splenic phenotype of neonatal mouse.; J,Toxicol,Sci. , 39 (4) , 571-578 (2014)
• 原著論文4: Kojima S,Tsukimoto M, Takeda K.etal; Purinergic signaling via P2X7 receptor mediates IL-1β production in Kupffer cells exposed to silica nanoparticle.; Toxicology. , 321 , 13-20 (2014)
• 原著論文5: Nagakura C,Takeda K, Kojima S.etal ; Involvement of P2Y11 receptor in silica nanoparticles 30-induced IL-6 production by human keratinocytes. ; Toxicology. , 322 , 61-68 (2014)
• 原著論文6: Hori H, Umezawa M, Takeda K.etal; Effect of high-fat diet prior to pregnancy on hepatic gene expression and histology in mouse offspring. ; Journal of Perinatal Medicine , 42 (1) , 83-91 (2014)
• 原著論文7: Onoda A, Umezawa M, Sugamata M.etal; Effects of maternal exposure to ultrafine carbon black on brain perivascular macrophages and surrounding astrocytes in offspring mice.; PLoS One, , 9 (4) , 94336-94336 (2014)
• 原著論文8: Kubo-Irie, Oshio S, Takeda K.etal; Dose-dependent biodistribution of prenatal exposure to rutile-type titanium dioxide nanoparticles on mouse testis.; J. Nanoparticle Res. , 16 , 2284-2284 (2014)
• 原著論文9: Suzuki K,TaniguchiR, Takeda K.etal; Tunable plasma lipoprotein uptake/transport across the blood-brain barrier.; Colloids and Surfaces A. , 442 , 157-163 (2014)
• 原著論文10: 梅澤雅和,柳田信也, 武田健,他; マイクロアレイ－MeSH法を用いた妊娠前の脂質過剰摂取による肝臓遺伝子発現変動の解析; 日本病態栄養学会誌 , 17 (3) , 331-337 (2014)
• 原著論文11: Umezawa M, Sekita K,Takeda K.etal; Effect of aerosol particles generated by ultrasonic humidifiers on the lung in mouse.; Part Fibre Toxicol , 10 , 64-64 (2013)
• 原著論文12: Kumamoto T,Takeda K, Oshio S.etal; Fetal exposure to diesel exhaust affects X-chromosome inactivation factor expression in mice.; Journal of Toxicological Sciences. , 38 (2) , 245-254 (2013)
• 原著論文13: Yokota S,Umezawa M,Takeda K.etal; Gene expression changes in the olfactory bulb of mice induced by exposure to diesel.exhaust are dependent on animal rearing environment.; PLOS ONE , 8 (8) , 70145-70145 (2013)
• 原著論文14: Okada Y, Tachibana K,Takeda K.etal; Prenatal exposure to zinc oxide particles alters monoaminergic neurotransmitter levels in the brain of mouse offspring.; Journal of Toxicological Sciences , 38 (3) , 363-370 (2013)
• 原著論文15: Yokota S,Umezawa M,Takeda K.etal; Exposure to diesel exhaust during fetal period affects behavior and neurotransmitters in male offspring mice.; Journal of Toxicological Sciences , 38 (1) , 13-23 (2013)
• 原著論文16: Umezawa M,Takeda K, Sugamata M.etal; Expression profile of extracellular matrix and adhesion molecules in the development of endometriosis in a mouse model.; Reproductive Sciences , 19 (12) , 1365-1372 (2012)
• 原著論文17: Umezawa M, Tainaka H, Takeda K.etal; Effect of fetal exposure to titanium dioxide nanoparticle on brain development − Brain region information.; Journal of Toxicological Sciences, , 37 (6) , 1247-1252 (2012)
• 原著論文18: Tainaka H, Umezawa M, Takeda K.etal; Evaluation of the testicular toxicity of prenatal exposure to bisphenol A based on microarray analysis combined with MeSH annotation.; Journal of Toxicological Sciences , 37 (3) , 539-548 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-01
• 更新日: 2018-05-29

収支報告書

• 文献番号: 201428004Z