肺胞蛋白症の吸入治療のための新規ＧＭ-ＣＳＦ製剤の非臨床試験

文献情報

• 文献番号: 201409004A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 肺胞蛋白症の吸入治療のための新規ＧＭ-ＣＳＦ製剤の非臨床試験
• 課題番号: H24-臨研推-一般-003
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 田澤 立之(新潟大学 医歯学総合病院)

研究分担者(所属機関)

• 中田　光(新潟大学　医歯学総合病院)
• 湯尾　明(国立国際医療研究センター研究所　疾患制御研究部)
• 井上　義一(国立病院機構近畿中央胸部疾患センター)
• 中垣　和英(日本獣医生命科学大学　獣医学部)
• 内田　寛治(東京大学　医学部)
• 井上　彰(東北大学　病院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 医療技術実用化総合研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 29,500,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

自己免疫性肺胞は,GM-CSFに対する自己抗体により，肺胞マクロファージのサーファクタント除去能が低下して呼吸不全を生じる稀少肺疾患である．標準治療は，手術室で全身麻酔下で20－30Lの温生理食塩水を使う全肺洗浄であるが，侵襲が大きい．外来で施行可能なより簡便な新規治療薬として本邦未承認のヒトGM-CSF製剤の吸入薬開発に向けた非臨床試験の方法を考えるため，CHO細胞および酵母由来製剤の関連企業と連携して，その薬理学的特性と哺乳動物を用いた吸入毒性試験方法を検討する．

研究方法

①薬理学的特性：肺胞マクロファージ(AM)へのGM-CSFとGM-CSF抗体の共刺激による効果を調べるため，サルAMをGM-CSFのみまたはGM-CSFとGM-CSF抗体の共存下で培養を行い、形態観察，ウシサーファクタント２時間処理しての観察，抗マンノース受容体抗体免疫染色を行った．CHO細胞由来製剤・酵母由来製剤および大腸菌由来製剤を用いて，正常ヒト由来のヒト骨髄血液細胞を作用対象細胞として，メチルセルロースを用いた半固形培地でコロニーアッセイを実施した． GM-CSFの生物活性評価のための好中球表面に発現する接着因子CD11bを測定するCD11b刺激indexの検討では，FITC-CD11b抗体を混和して測定し，GM-CSF刺激による基礎値からの上昇率を比較した．
②吸入毒性試験の方法の検討：ヒトGM-CSFは，種特異性が高くげっ歯類等の動物で生理活性を示さないためカニクイザルにおいて以下の2実験を行った．②-1.GM-CSF単回投与実験：カニクイザルにGM-CSF 製剤を気管内噴霧単回投与（0.05 mg/body）又は2種のネブライザー（膜型/ジェット）（0.5 mg/body）を用いて単回吸入投与し，投与後24時間まで経時的に血漿を採取した．②‐2.CHO細胞由来および大腸菌由来製剤を，気管内噴霧投与（15μg/回，2回/週，12週）を各製剤オス2例のカニクイザルに施行し定期的な抗体の検出，気管支肺胞洗浄液（BALF）採取，剖検で評価した．血漿のGM-CSF中和活性は，血漿を系列希釈し，GM-CSFを加え中和されずに残存したGM-CSF活性をTF-1の増殖によって測定した．委託先の動物実験審査委員会ならびに新潟大学動物実験倫理委員会に動物実験計画書を提出し，指摘事項を修正し，承認を受けた（単回投与実験：26新大研第240号3，抗体観察実験：26新大研第204号1）．
③非臨床試験・臨床試験計画：以上の結果をもとに，2014年10月24日に対面助言を受け，本研究の目的である6か月反復吸入毒性試験計画，医師主導治験での検証試験計画書，健常成人薬物動態調査計画を策定した．

結果と考察

本研究では今年度以下の結果が得られた．①サル肺胞マクロファージをin vitroでヒトGM-CSFとGM-CSF抗体存在下で培養するとサーファクタント処理能が低下し泡沫状マクロファージとなりうる．②コロニーアッセイでは3製剤とも同様の活性を示し，大腸菌由来製剤の活性がやや高い傾向にあった.③CD11b刺激indexは，Intra-individual variationが有意に小さく，異なるサンプル同士の比較が可能なことが分かった．④カニクイザルへのGM-CSF 製剤の単回吸入投与を，気管内噴霧，膜型/ジェットネブライザーで行い，いずれの方法でも血中GM-CSF濃度推移・薬物動態解析が可能であった．⑥GMCSFのカニクイザルへ12週間の間欠的経気道反復投与は，一般状態の変化なく2コース目と3コース目（週1回投与）を施行でき，抗GM-CSF抗体の中和能は個体差が大きく，一部で泡沫状マクロファージをみられた．⑦以上の結果および酵母由来製剤の製造企業からの協力を得て，PMDAの薬事戦略相談での対面助言を受けて，26週反復吸入投与毒性試験，検証試験，健常成人薬物動態試験の計画を策定した．

結論

本研究での結果，CHO細胞，酵母，大腸菌由来の3製剤は薬理学的にほぼ同様の作用を示し，カニクイザルへのネブライザーでの単回投与で血中濃度の推移が測定でき，スプレーでの長期反復投与はサルの一般状態は変わらずに施行できることがわかった．連携企業の意向より酵母由来製剤での医師主導治験の可能性が考えられるようになり， PMDAとの薬事戦略相談事前相談の結果をもとに，非臨床試験・検証試験の実施計画案を作り，連携企業からの資料も添付して対面助言を受けた．対面助言での機構の意見・見解をもとに，26週反復吸入投与毒性試験，医師主導治験による検証試験，薬物動態試験の計画を策定できた．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-01
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201409004B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 肺胞蛋白症の吸入治療のための新規ＧＭ-ＣＳＦ製剤の非臨床試験
• 課題番号: H24-臨研推-一般-003
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 田澤 立之(新潟大学 医歯学総合病院)

研究分担者(所属機関)

• 中田　光(新潟大学　医歯学総合病院)
• 湯尾　明(国立国際医療研究センター研究所　疾患制御研究部)
• 井上　義一(国立病院機構近畿中央胸部疾患センター)
• 中垣　和英(日本獣医生命科学大学　獣医学部)
• 内田　寛治(東京大学　医学部)
• 井上　彰(東北大学病院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 【補助金】 医療技術実用化総合研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

肺胞蛋白症は，肺胞の構造維持に重要なサーファクタント物質が末梢気腔内に異常に蓄積して呼吸不全を呈する疾患で，その9割が顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）に対する自己抗体が原因と考えられる自己免疫性肺胞蛋白症である．標準治療は，全身麻酔下での全肺洗浄とされるが侵襲が大きいため，私たちの研究グループでは，より簡便な治療としてGM-CSF吸入の治療研究を2000年より開始し，2005年―2008年に本邦9施設による多施設第2相試験を世界に先駆けて実施し，その有効性と安全性を示した．本研究では，本邦未承認のヒトリコンビナントGM-CSF製剤の吸入薬開発のための非臨床試験の方法を考えるため，CHO細胞由来製剤および酵母由来製剤の関連企業と連携して，その薬理学的特性と哺乳動物を用いた吸入毒性試験の方法を検討した．①コロニーアッセイによる増殖分化誘導作用の評価，②糖鎖修飾と生理活性との関連，③CD11b発現量測定によるシグナル伝達の評価，④他の動物種での活性，⑤気道内単回投与実験，⑥反復投与での抗体の出現，について検討した．

研究方法

コロニーアッセイは，正常ヒト由来のヒト骨髄血液細胞を作用対象細胞として，メチルセルロースを用いた半固形培地で実施した．Ultraflex TOF/TOF mass spectrometersで質量分析を行った．ELISAの系でGM-CSF製剤を各種濃度でプレートにコートして，患者血清との反応性を評価した．Avidityの測定に8M urea 変性法を用いた．TF-1 細胞をGM-CSF 添加無血清培地中で培養し，MTTアッセイで細胞増殖を評価した．CHO細胞由来製剤の糖鎖の解析は，シアリダーゼ処理により行った．細胞のCD11bの量をFACSで定量し、GM-CSF刺激による細胞のCD11b量の変化を調べた．各用量雌雄各1 例（中等用量では2例）のカニクイザルにGM-CSF 製剤をマイクロスプレーでの単回気管内噴霧投与（0.005，0.05 及び0.5 mg/body）又は2種のネブライザー（膜型/ジェット）を用いて単回吸入投与（0.05，0.5 及び5 mg/body）し，投与後24時間まで経時的に採血した．GMCSF製剤を，気管内噴霧投与（15μg/body/回，2回/週―3コース目のみ1回/週―，12週）をオス２例のカニクイザルに施行し，定期的に採血し抗体の検出を行い，12週後に細径気管支ファイバースコープによる気管支肺胞洗浄液（BALF）採取を行った．動物実験にあたっては委託先施設の動物実験審査委員会ならびに新潟大学動物実験倫理委員会に実験計画書を提出し承認を受けた．PMDAの薬事戦略相談事前相談（2012年9月7日，2013年7月30日，2014年3月28日）の結果をもとに，非臨床試験および検証試験に関して，2014年10月24日に対面助言を受けた．

結果と考察

①CHO細胞，酵母，大腸菌由来の3製剤の比較では，コロニーアッセイではほぼ同等の活性をもち，②CHO細胞由来製剤は質量分析で糖鎖修飾が多く，患者由来GM-CSF抗体とのavidityはやや低いが，GM-CSF依存性細胞株の生残率は高く，シアリダーゼ処理による検討で，シアリル化糖鎖のため細胞への結合・内在化・分解が遅れ生理活性が持続する可能性が示され，③好中球表面のCD11b発現量およびSTAT5のリン酸化反応の評価でも，上記３製剤はほぼ同等の活性をもち，④ヒトGM-CSFは，マウス末梢血顆粒球への活性はないが，イヌおよびウサギの末梢血顆粒球のCD11bの発現増強がわずかにみられ，⑤カニクイザルへのGM-CSF 製剤の気管内噴霧，膜型ネブライザー，ジェットネブライザーによる単回投与試験では，いずれの方法でも血中GM-CSF濃度推移・薬物動態解析が可能で，⑥GM-CSF製剤のカニクイザルへの12週間の間欠的経気道反復投与は，一般状態変化なく3コース施行でき，抗GM-CSF抗体と泡沫状肺胞マクロファージが出現し，抗体の中和活性については個体差が大きいことが示された．以上の結果および酵母由来製剤の製造企業からの協力を得て，PMDAの薬事戦略相談での対面助言を受けて，6カ月間反復吸入投与毒性試験，検証試験，健常成人薬物動態試験の計画を策定した．

結論

本研究で，上記3製剤は同様の薬理活性をもつこと，臨床試験と同じネブライザーでのカニクイザルへの単回吸入投与で薬物動態解析が可能なこと，カニクイザルでの長期反復経気道投与が一般状態に変化なく可能なことが明らかになった．これらの結果をもとに対面助言での見解を盛り込み上記の計画案が策定され，日本医療研究開発機構研究費へ分担研究者の中田を研究代表者として応募がなされ，幸いに採択され，平成27年度よりこれらの試験を開始の予定である．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-01
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201409004C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 大腸菌，酵母，CHO細胞由来のGM-CSF製剤の物性・薬理作用の評価では，3製剤とも同様の結果を示した．CHO細胞由来のGM-CSF製剤では，糖鎖修飾が多く，細胞への結合・内在化・分解が遅れて生理活性が続くことを示唆する結果が得られ，論文発表された．さらに，白血球のCD11bの発現評価は，実験条件を厳密に制御すると再現性のよい簡便なGM-CSF信号伝達の評価方法であることが分かり論文発表された．GM-CSF製剤のネブライザーでのカニクイザルへの投与で，血中濃度が測定可能であることが示された．
• 臨床的観点からの成果: GM-CSF製剤の気管内へのマイクロスプレーでの間欠的長期投与（1回5mcg/kg週2回，12週間）予備実験では，一般状態・検査所見で著変なく実施可能で，開始4週後で抗体が出現するが，その中和活性は個体差が大きいことが分かった．さらに，8-12週の休薬期間をおいての繰り返し投与も可能であった．以上の結果より非臨床試験の反復吸入投与毒性試験計画，医師主導治験による検証試験実施計画，薬物動態調査計画案を作り，連携企業の協力を得て医薬品医療機器総合機構の対面助言を受けて修正を加えて実施案を策定できた．
• ガイドライン等の開発: 研究代表者は，難治性疾患等克服研究事業での肺胞蛋白症の研究に加わっており，「肺胞蛋白症の診断、治療、管理の指針」（平成24年3月28日Ver.6.2)において，「自己免疫性肺胞蛋白症の診断，鑑別診断」，「自己面形成肺胞蛋白症の診断基準」，「自己免疫性肺胞蛋白症の試験的新治療」の項を担当した．
• その他行政的観点からの成果: 本研究で，GM-CSF吸入製剤について，非臨床試験の反復吸入投与毒性試験ならびに検証試験と薬物動態試験よりなる医師主導治験実施計画書案が策定され，分担研究者の中田を研究代表者として日本医療研究開発機構研究費に応募がなされ，幸いに採択され，平成27年度よりこれらの試験が開始される予定である．なお研究代表者は，難治性疾患等克服研究事業での肺胞蛋白症の研究に加わっており，「肺胞蛋白症（自己免疫性又は先天性）」は，2015年4月に厚生科学審議会疾病対策部会指定難病検討委員会で，指定難病の指定を受けた．
• その他のインパクト: 研究代表者は，日本肺胞蛋白症患者会（2010年10月発足，小林剛志代表）の活動に協力しており，同患者会の第4回肺胞蛋白症勉強会（2012年11月26日，東京），第5回肺胞蛋白症勉強会（2013年6月4日，大阪），第6回肺胞蛋白症勉強会（2014年11月23日，東京）にて肺胞蛋白症とGM-CSF吸入治療に関する講演を行い，司会を務めた．

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 14件
• その他論文(和文): 5件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 3件
• 学会発表(国際学会等): 18件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 1件
• その他成果(普及・啓発活動): 1件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Akasaka K, Tanaka T, Maruyama T, et al.; A mathematical model to predict protein wash out kinetics during whole-lung lavage in autoimmune pulmonary alveolar proteinosis.; Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. , 308 (2) , L105-L117 (2015); 10.1152/ajplung.00239.2014.
• 原著論文2: Nakagaki K, Nunomura Y, Uchida K, et al.; Up-regulation of cluster of differentiation (CD) 11b expression on the surface of canine granulocytes with human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF).; J Vet Med Sci. , 76 (8) , 1173-1176 (2014); 10.1292/jvms.14-0056
• 原著論文3: Hashimoto A, Tanaka T, Itoh Y, et al.; Low concentrations of recombinant granulocyte macrophage-colony stimulating factor derived from Chinese hamster ovary cells augments long-term bioactivity with delayed clearance in vitro.; Cytokine , 68 (2) , 118-126 (2014); 10.1016/j.cyto.2014.03.009.
• 原著論文4: Tazawa R, Inoue Y, Arai T, et al.; Duration of benefit in patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis after inhaled granulocyte-macrophage colony-stimulating factor therapy.; Chest , 145 (4) , 729-737 (2014); 10.1378/chest.13-0603.
• 原著論文5: Kusakabe Y, Uchida K, Hiruma T, et al.; A standardized blood test for the routine clinical diagnosis of impaired GM-CSF signaling using flow cytometry.; J Immunol Methods. , 413 , 1-11 (2014); 10.1016/j.jim.2014.07.009.
• 原著論文6: Ishii H, Seymour JF, Tazawa R, et al.; Secondary pulmonary alveolar proteinosis complicating myelodysplastic syndrome results in worsening of prognosis: a retrospective cohort study in Japan.; BMC Pulmonary Medicine , 4 , 37- (2014); 10.1186/1471-2466-14-37.
• 原著論文7: Nei T, Urano S, Itoh Y, et al.; Light chain (κ/λ) ratio of GM-CSF autoantibodies is associated with disease severity in autoimmune pulmonary alveolar proteinosis.; Clin Immunol. , 149 (3) , 357-364 (2013); 10.1016/j.clim.2013.10.002.
• 原著論文8: Tazawa R, Nakata K; Pulmonary alveolar proteinosis and granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) inhalation; Expert Opin Orphan Drugs , 4 (1) , 115-123 (2016); 10.1517/21678707.2016.1123150
• 原著論文9: Ito M, Nakagome K, Tazawa R, et al; Elderly-onset hereditary pulmonary alveolar proteinosis and its cytokine profile.; BMC Pulmonary Medicine , 17 (1) , 40- (2017); 10.1186/s12890-017-0382-x.
• 原著論文10: Ohkouchi S, Akasaka K, Tazawa R, et al.; Sequential GM-CSF Inhalation after Whole Lung Lavage for Pulmonary Alveolar Proteinosis: A Report of Five Intractable Cases; Ann Am Thorac Soc. , 14 (8) , 1298-1304 (2017); 10.1513/AnnalsATS.201611-892BC
• 原著論文11: Tokura S, Akira M, Okuma T, Tazawa R, et al; A Semiquantitative CT Grading System for Evaluating Therapeutic Response in Pulmonary Alveolar Proteinosis.; Ann Am Thorac Soc. , 14 (9) , 1403-1411 (2017); 10.1513/AnnalsATS.201607-574OC.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-16
• 更新日: 2020-05-15

収支報告書

• 文献番号: 201409004Z