デルマタン４－Ｏ－硫酸基転移酵素－１欠損に基づくエーラスダンロス症候群の病態解明と治療法の開発

文献情報

• 文献番号: 201324111A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: デルマタン４－Ｏ－硫酸基転移酵素－１欠損に基づくエーラスダンロス症候群の病態解明と治療法の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-難治等（難）-一般-073
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 古庄 知己(国立大学法人信州大学 医学部附属病院遺伝子診療部)

研究分担者(所属機関)

• 小林　身哉(金城学院大学　生活環境学部食環境栄養学科)
• 菅原　一幸(北海道大学　大学院先端生命科学研究院生命機能科学研究部門プロテオグリカン医療応用研究室)
• 福嶋　義光(信州大学　医学部遺伝医学予防医学)
• 籏持　淳(獨協医科大学　皮膚科)
• 武田　伸一(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所遺伝子疾患治療研究部)
• 佐々木　克典(信州大学　医学部組織発生学講座)
• 中山　淳(信州大学　大学院医学系研究科分子病理学)
• 松本　直通(横浜市立大学　大学院医学研究科遺伝学)
• 野村　義宏(東京農工大学　農学部硬蛋白質利用研究施設)
• 岡田　尚巳(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所遺伝子疾患治療研究部)
• 三宅　紀子(横浜市立大学　大学院医学研究科遺伝学)
• 岳　鳳鳴（ガク　ホウメイ）(信州大学　医学部組織発生学講座)
• 水本　秀二(名城大学　薬学部病態生化学糖鎖医学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（難治性疾患克服研究）
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 5,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: 研究分担者・水本秀二博士が、平成25年10月1日に、北海道大学大学院先端生命科学研究院・生命機能科学研究部門・プロテオグリカン医療応用研究室薬学（博士研究員）から、名城大学薬学部病態生化学糖鎖医学（助教）に異動したため、所属機関変更の手続きを行った。

研究報告書（概要版）

研究目的

エーラスダンロス症候群（Ehlers-Danlos Syndrome; EDS）は、皮膚・関節の過伸展性、各種組織の脆弱性を特徴とする先天性疾患の総称である。研究代表者らは、平成21－23年度難治性疾患克服研究事業の支援を受けて、進行性結合組織脆弱性（皮膚過伸展・脆弱性、全身関節弛緩・脱臼・変形、巨大皮下血腫）、発生異常（顔貌の特徴、先天性多発関節拘縮）に特徴付けられるEDSの新病型を見出した。さらに、原因遺伝子がデルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1（D4ST1）をコードするCHST14であること、本症における進行性結合組織脆弱性は「D4ST1の欠損→デコリンに付加するグリコサミノグリカン鎖の組成変化（正常ではデルマタン硫酸[DS]であるが、患者ではコンドロイチン硫酸[CS]に置換）→デコリンを介するコラーゲン細線維のassembly不全」によることを明らかにした。ほぼ同時に、稀な多発関節拘縮症”Adducted thumb-clubfoot syndrome”および他のEDS患者においてCHST14変異が見出された。研究代表者らは、詳細な臨床的検討から、これらを同一疾患と結論付け、デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1欠損に基づくエーラスダンロス症候群（D4ST1-deficient EDS；DDEDS）と命名、その診療指針を提案した。
本研究班は、臨床遺伝、遺伝子解析、病理解析、糖鎖医学解析、再生医療、遺伝子治療の専門家が結集し、DDEDSの自然歴および健康管理指針の構築と根治療法の開発を目指すことにより、進行性の結合組織脆弱性病変に苦しむ患者のQOLを向上させることである。

研究方法

臨床的検討として、疑い例の収集、確定診断例における反復性皮下血腫に対するDDAVP療法の有効性検討および聴覚評価を行った。遺伝子解析として、疑い例に対するCHST14遺伝子直接シーケンス解析、陰性例に対する全エクソーム解析を行った。病理解析として、患者およびホモ（Chst14-/-）マウスを対象に、皮膚、胃粘膜などのHE染色、デコリン免疫染色を行った。糖鎖医学的解析として、ホモマウスの皮膚および尿中のDS分析を行った。iPS細胞を用いた解析として、1人の患者由来iPS細胞の神経系分化能の詳細をマイクロアレイ発現解析により調べた。ホモマウスを用いた解析として、モデルマウスとしての妥当性を臨床症状、糖鎖医学的分析、病理解析などにより検討した。遺伝子治療研究として、ヒトCHST14遺伝子またはマウスChst14遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを感染させたヒト腎臓由来の293細胞およびヘテロ（Chst14+/-）マウス由来皮膚線維芽細胞における硫酸基転移酵素活性を調べた。

結果と考察

臨床的には、新たに2家系3症例を収集、DDAVPによる反復性皮下血腫予防効果の確認、高音域の聴覚低下を示した。変異陰性例に対して全エクソーム解析が行われたが、原因遺伝子同定には至らず、検出しにくい他の原因遺伝子の存在が示唆された。病理では、ホモマウスの皮膚においてデコリン陽性線維の分布が粗になっており、患者同様皮膚コラーゲンネットワーク構造に異常を来していることが示唆された。糖鎖医学的解析では、ホモマウスの皮膚においてDSは完全欠損しており、患者と同様であった。iPS細胞を用いた解析では、神経細胞発達・分化調節に関わる遺伝子群の発現低下が示され、患者の中枢神経症状との関連が注目される。ホモマウスはDDEDS患者同様尿や皮膚中DSの著減を呈し、D4ST1酵素活性喪失に基づく病態を再現していると考えられた。また、ヘテロ、WTマウスと比べて、低体重、脊椎後彎、顔面非対称、皮膚脆弱性、筋力低下など患者と類似の症状を示した。CHST14またはChst14を組み込んだAAVベクターを感染させた193細胞、ヘテロマウス由来皮膚線維芽細胞では、ネガティブコントロールと比較して、３倍以上の有意な硫酸基転移活性上昇を示し、遺伝子導入したD4ST1タンパクが機能性であることが示された。さらに、D4ST1発現AAVベクターの大量調製に成功し、モデル動物を用いた治療実験の準備が整った。

結論

確定診断例は論文誌上の発表、研究会での報告を加え合計30家系41患者となり、EDSの重要な病型と位置付けられる。本研究班で樹立したiPS細胞およびノックアウトマウスは病態を再現しており病態解析・治療研究に使用しうる適切なモデルである。AAVベクターを利用した遺伝子治療は有望な治療戦略であると期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201324111B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: デルマタン４－Ｏ－硫酸基転移酵素－１欠損に基づくエーラスダンロス症候群の病態解明と治療法の開発
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-難治等（難）-一般-073
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 古庄 知己(国立大学法人信州大学 医学部附属病院遺伝子診療部)

研究分担者(所属機関)

• 小林　身哉(金城学院大学　生活環境学部食環境栄養学科)
• 菅原　一幸(北海道大学　大学院先端生命科学研究院生命機能科学研究部門プロテオグリカン医療応用研究室)
• 福嶋　義光(信州大学　医学部遺伝医学・予防医学)
• 籏持　淳(協医科大学　皮膚科)
• 武田　伸一(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所遺伝子疾患治療研究部)
• 佐々木　克典(信州大学　医学部組織発生学講座)
• 中山　淳(信州大学　大学院医学系研究科分子病理学)
• 松本　直通(横浜市立大学　大学院医学研究科遺伝学)
• 野村　義宏(東京農工大学　農学部硬蛋白質利用研究施設)
• 岡田　尚巳(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所遺伝子疾患治療研究部)
• 三宅　紀子(横浜市立大学　大学院医学研究科遺伝学)
• 岳　鳳鳴（ガク　ホウメイ）(信州大学　医学部組織発生学講座)
• 水本　秀二(名城大学　薬学部病態生化学糖鎖医学)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 難治性疾患等克服研究（難治性疾患克服研究）
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 研究分担者・水本秀二博士が、平成25年10月1日に、北海道大学大学院先端生命科学研究院・生命機能科学研究部門・プロテオグリカン医療応用研究室薬学（博士研究員）から、名城大学薬学部病態生化学糖鎖医学（助教）に異動したため、所属機関変更の手続きを行った。

研究報告書（概要版）

研究目的

エーラスダンロス症候群（Ehlers-Danlos Syndrome; EDS）は、皮膚・関節の過伸展性、各種組織の脆弱性を特徴とする先天性疾患の総称である。研究代表者らは、平成21－23年度難治性疾患克服研究事業の支援を受けて、進行性結合組織脆弱性（皮膚過伸展・脆弱性、全身関節弛緩・脱臼・変形、巨大皮下血腫）、発生異常（顔貌の特徴、先天性多発関節拘縮）に特徴付けられるEDSの新病型を見出した。さらに、原因遺伝子がデルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1（D4ST1）をコードするCHST14であること、本症における進行性結合組織脆弱性は「D4ST1の欠損→デコリンに付加するグリコサミノグリカン鎖の組成変化（正常ではデルマタン硫酸[DS]であるが、患者ではコンドロイチン硫酸[CS]に置換）→デコリンを介するコラーゲン細線維のassembly不全」によることを明らかにした。ほぼ同時に、稀な多発関節拘縮症”Adducted thumb-clubfoot syndrome”および他のEDS患者においてCHST14変異が見出された。研究代表者らは、詳細な臨床的検討から、これらを同一疾患と結論付け、デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1欠損に基づくエーラスダンロス症候群（D4ST1-deficient EDS；DDEDS）と命名、その診療指針を提案した。
本研究班は、臨床遺伝、遺伝子解析、病理解析、糖鎖医学解析、再生医療、遺伝子治療の専門家が結集し、DDEDSの自然歴および健康管理指針の構築と根治療法の開発を目指すことにより、進行性の結合組織脆弱性病変に苦しむ患者のQOLを向上させることである。

研究方法

臨床的検討として、疑い例の収集、確定診断例における反復性皮下血腫に対するDDAVP療法の有効性検討および聴覚評価を行った。遺伝子解析として、疑い例に対するCHST14遺伝子直接シーケンス解析、陰性例に対する全エクソーム解析を行った。病理解析として、患者およびホモ（Chst14-/-）マウスに対し、皮膚、胃粘膜などのHE染色、デコリン免疫染色を行った。糖鎖医学的解析として、患者およびホモマウスの皮膚および尿中のDS分析を行った。iPS細胞を用いた解析として、1人の患者由来iPS細胞を樹立、未分化能、多能性、神経細胞への分化能を検討した。ホモマウスを用いた病態解析として、モデルマウスとしての妥当性を検討した。遺伝子治療研究として、ヒトCHST14遺伝子またはマウスChst14遺伝子を組み込んだアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを作成、感染させたヒト腎臓由来の293細胞およびヘテロ（Chst14+/-）マウス由来皮膚線維芽細胞における硫酸基転移酵素活性を調べた。

結果と考察

臨床的には、新たに3家系4症例を収集、DDAVPによる反復性皮下血腫予防効果を確認、高音域の聴覚低下を見出した。変異陰性例に対して全エクソーム解析が行われたが、原因遺伝子同定には至らず、他の原因遺伝子の存在が示唆された。病理では、患者においては表皮直下のコラーゲン線維束が繊細になり、抗デコリン抗体を用いた免疫染色で明らかな異常パターンを呈した。ホモマウスの皮膚においてデコリン陽性線維の分布が粗になっており、患者同様皮膚コラーゲンネットワーク構造に異常を来していることが示唆された。糖鎖医学的解析では、患者およびホモマウスの皮膚および尿においてDSは完全欠損していた。患者由来iPS細胞は、健常人由来iPS細胞と同様の未分化能、多能性を呈し、SKIDマウスに発症させた奇形腫では患者同様の抗デコリン抗体染色パターンを呈した。神経細胞への分化誘導効率は低く、マイクロアレイ解析で発達・分化調節に関わる遺伝子群の発現低下が示された。ホモマウスは患者同様尿や皮膚中DSの消失を呈し、D4ST1酵素活性喪失に基づく病態を再現していた。また、ヘテロ、WTマウスと比べて、低体重、脊椎後彎、顔面非対称、皮膚脆弱性、筋力低下など患者と類似の症状を示した。CHST14またはChst14を組み込んだAAVベクターを感染させた193細胞、ヘテロマウス由来皮膚線維芽細胞では、ネガティブコントロールと比較して、３倍以上の有意な硫酸基転移活性上昇を示し、遺伝子導入したD4ST1タンパクが機能性であることが示された。さらに、D4ST1発現AAVベクターの大量調製に成功し、モデル動物を用いた治療実験の準備が整った。

結論

確定診断例は論文誌上の発表、研究会での報告を加え合計30家系41患者となり、EDSの重要な病型と位置付けられる。本研究班で樹立したiPS細胞およびノックアウトマウスは病態を再現しており病態解析・治療研究に使用しうる適切なモデルである。AAVベクターを利用した遺伝子治療は有望な治療戦略であると期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201324111C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 本症は、研究代表者が疾患を発見、分担者とともに原因遺伝子を同定、疾患概念を構築した新規疾患であり、デルマタン硫酸（DS）欠乏による生体への影響を示す唯一の疾患モデルである。現在取り組んでいるiPS細胞やノックアウトマウスによる詳細な病態解析により、DS欠乏がコラーゲンネットワークにどのような影響を与え、それがどのような臓器障害や臨床症状に至るか、明らかになりつつある。遺伝子治療など先端治療の開発に加えて、DSの生体への意義を考察する上でもきわめて重要な学術的意味のある研究である。
• 臨床的観点からの成果: 全世界で合計30家系41患者が確認され、増え続けていることから、本症は、重要なEDSの一病型であると考えられる。診療指針の提案に加えて、巨大皮下血腫に対するDDAVP療法や特徴的な聴力像に関する知見が増え、診療上有用な情報が集積した。適切なマネジメントにより、患者のADL、QOLの向上が期待されるのみならず、対応する多くの診療科（整形外科、皮膚科、循環器科、眼科、耳鼻科、呼吸器科、消化器科、泌尿器科など）の診療をサポートするものになっており、臨床的にも価値ある研究となっている。
• ガイドライン等の開発: 平成21-23年度EDS班（研究代表者：古庄知己）の活動により、本症の診療指針を提案した。新生児期、顔貌上の特徴、骨格症状（内転母指、内反足を含む多発関節拘縮）で疑い、CHST14遺伝子解析を行う。診断時、先天性心疾患、眼奇形、泌尿生殖器奇形、難聴の有無を評価。乳幼児期、内反足に対する整形外科的治療、運動発達遅滞に対する理学療法、便秘対策、男児では停留精巣固定術。以後、各科定期検診、外傷対策（巨大皮下血腫時のDDAVP点鼻療法）、思春期以降の（血）気胸、腸憩室穿孔への対応などを考慮する。
• その他行政的観点からの成果: 本症は本邦で発見された遺伝性の難病であり、厚生労働科学研究費難治性疾患克服研究事業の支援を受けて、本邦の多施設・多専門分野の研究者からなる研究チームにより原因遺伝子単離、病態解明、そして病態に基づく新規治療法の開発が行われてきた。まさに厚生労働省の提案する難病基盤研究の理想的あり方にのっとった研究状況であり、新規に見出される難病研究のモデルとなるだろう。今後、遺伝子治療などの治療研究が進展すれば、医師主導治験を経て、保険収載化をめざすことになる。これは、稀少難病創薬のモデルとなると期待される。
• その他のインパクト: 本研究の最大のインパクトは、新規疾患を、本邦で発見し、原因遺伝子を単離、病態を解明、そして病態に即した根本治療の開発に至るまで世界をリードし続けていることである。こうした取り組みは国内では平成25年度日本小児科学会最優秀演題賞、日本医師会医学研究奨励賞の受賞という形で評価され、またEDS国際会議においても、研究代表者は本疾患を含むEDS病型に対する臨床研究のプロジェクトリーダーに任命された。また患者会（JEFA）では毎年研究の進行状況を発表している。

発表件数

• 原著論文（和文）: 5件
• 原著論文（英文等）: 145件
• その他論文(和文): 8件
• その他論文(英文等): 4件
• 学会発表(国内学会): 14件
• 学会発表(国際学会等): 20件
• その他成果(特許の出願): 15件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 51件 ; 国内外の招待講演

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Shimizu K, Wakui K, Kosho T, et al.; Microarray and FISH-based genotype-phenotype analysis of 22 Japanese patients with Wolf-Hirschhorn syndrome.; Am J Med Genet A , 164A (3) , 597-609 (2014); 10.1002/ajmg.a.36308
• 原著論文2: Nishi E, Takamizawa S, Iio K,et al.; Surgical intervention for esophageal atresia in patients with trisomy 18.; Am J Med Genet A , 164A (2) , 324-330 (2014); 10.1002/ajmg.a.36294
• 原著論文3: Kosho T, Kuniba H, Tanikawa Y, et al.; Natural history and parental experience of children with trisomy 18 based on a questionnaire given to a Japanese trisomy 18 parental support group.; Am J Med Genet A , 161A (7) , 1531-1542 (2013); 10.1002/ajmg.a.35990
• 原著論文4: Kosho T, Okamoto N, Ohashi H, et al.; Clinical correlations of mutations affecting six components of the SWI/SNF complex: detailed description of 21 patients and a review of the literature.; Am J Med Genet A , 161A (6) , 1221-1237 (2013); 10.1002/ajmg.a.35933
• 原著論文5: Tsurusaki Y, Kosho T, Hatasaki K, et al.; Exome sequencing in a family with an X-linked lethal malformation syndrome: clinical consequences of hemizygous truncating OFD1 mutations in male patients.; Clin Genet , 83 (2) , 135-144 (2013); 10.1111/j.1399-0004.2012.01885.x
• 原著論文6: Kosho T; Discovery and delineation of dermatan 4-O-sulfotransferase-1 (D4ST1)-deficient Ehlers-Danlos syndrome; Current Genetics in Dermatology , 73-86 (2013)
• 原著論文7: 古庄知己; デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1欠損に基づく新型エーラスダンロス症候群の発見と疾患概念の確立; 日本遺伝カウンセリング学会誌 , 34 (1) , 21-29 (2013)
• 原著論文8: 古庄知己; グリコサミノグリカンの異常と新型Ehlers-Danlos症候群（古庄型）; 病理と臨床 , 31 (8) , 852-860 (2013)
• 原著論文9: Kosho T; CHST14/D4ST1 deficiency: New form of Ehlers–Danlos syndrome; Pediatrics International , 58 (2) , 88-99 (2016); 10.1111/ped.12878

公開日・更新日

• 公開日: 2014-06-02
• 更新日: 2017-05-25

収支報告書

• 文献番号: 201324111Z