ヒトパピローマウイルスを標的とする発がん予防の研究

文献情報

• 文献番号: 201313011A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ヒトパピローマウイルスを標的とする発がん予防の研究
• 課題番号: H22-３次がん-一般-015
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 温川 恭至(独立行政法人 国立がん研究センター 研究所 ウイルス発がん研究分野)

研究分担者(所属機関)

• 川名　敬(東京大学大学院　医学部　医学系研究科)
• 酒井　博幸(京都大学ウイルス研究所　がんウイルス部門　がん遺伝子研究分野)
• 森　清一郎(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 中川　俊介(帝京大学　医学部　産婦人科)
• 大和　建嗣(筑波大学　医学医療系　消化器内科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 34,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　HPVはほぼ全ての子宮頸がんの原因であり、全がんの5%、 女性のがんの11%の原因となっている。HPV16、18のL1蛋白を抗原とする現行HPV感染予防ワクチンは16、18型以外に対する感染予防効果がないか低い。また、既感染者に対する治療効果は全くない。そこで、発がん性HPV群の感染予防、HPV潜伏感染の阻止、前がん病変の排除等による子宮頸がんの予防法を開発し子宮頸がんの罹患率・死亡率を減少させることが研究の目的である。

研究方法

　新たな抗原として、B型肝炎ウイルスワクチンであるHBs抗原とL2-56/75との融合蛋白（HBs-56/75）を化血研との共同研究により作製した。HBs-56/75による中和抗体価誘導能を調べた。HPV16 E7を抗原としCTL誘導とCIN3病変の治療を目指した経口治療ワクチン(GLB101c)の探索的第I/IIa相臨床試験を終了し、CIN3からCIN2への退縮例の追跡調査ならびにE7特異的細胞性免疫を調べた。プロテアソーム阻害剤であるMG132封埋ミセルを東大片岡研の協力により開発、調製した。MG132単独投与とミセル化MG132の腫瘍集積性や抗腫瘍効果を比較した。E6 siRNAをポリエチレングリコール(PEG)で内包した高分子ミセルを東大片岡研の協力により開発、調製し、静脈投与により子宮頸癌担癌マウスに対する抗腫瘍効果を調べた。siRNAの副作用である非特異的細胞増殖抑制効果や細胞毒性がDNA-RNAキメラ化により軽減できるかを調べ、副作用の発現機構を解析した。HPVゲノムを複製維持する細胞株を樹立し、ゲノム内のL1/L2領域にレポーター遺伝子を異なる位置や方向に分泌型ルシフェラーゼ遺伝子発現カセットを搭載しレポーターの発現とゲノムコピー数との関連を調べた。

結果と考察

　HBs-56/75抗原は、抗HBs抗体に加え交差性HPV中和抗体を効率よく誘導した。幅広い型のHPVとHBVに有効な多価ワクチンとして有望である。HBs抗原ワクチンは安全性・製造法が確立しておりコストも安く、発展途上国への普及も期待できる。経口HPV治療ワクチンは子宮頸部におけるE7特異的IFN gamma、granzyme B産生細胞誘導能と病理組織像の改善との間には相関が見られた。このようなHPV経口治療ワクチンの成果は世界に類をみない。一方、長期間の追跡期間中もCIN3への再増悪がないだけでなく、CIN1への消退例や正常化例も見られた。E6E7高発現は免疫監視機構を阻害することからE7高発現細胞が除去されることにより自然消退が促進される可能性も示唆された。ナノミセル化MG132は裸剤に比べHPV陽性子宮頸がん細胞移植マウスにおいて腫瘍集積性と抗腫瘍効果に優れており、ナノミセル化によるEPR効果によるものと推測された。ナノミセル化E6 siRNAを子宮頸癌担癌マウスに尾静脈接種すると明らかな抗腫瘍効果が見られた。新たなDNA置換体（idRNA）によってsiRNAの副作用である非特異的細胞増殖抑制効果を抑制できるため、E6E7を標的としたRNAi医薬への応用に有用であると考えられた。これらの成果を融合し、今後はidRNAの高分子ミセル化の効果を確かめる必要がある。HPVゲノム内のL1/L2領域に搭載したレポーター遺伝子の発現量は位置や方向により大きく異なったが、どの位置、方向でもゲノムの複製は維持された。また、ゲノムコピー数とレポーター遺伝子発現との間には相関が認められ、レポーター遺伝子発現によりゲノムコピー数をモニターすることが可能となった。複製阻害剤のハイスループット スクリーニング系として有望である。HPV複製を阻害する薬剤としてCDK9阻害剤を同定した。

結論

　HBs抗原にHPV16 L2-56/75領域を挿入したキメラ抗原は、幅広い型のHPVとHBVの双方に有効な多価ワクチンとして有望である。一方、HPV16 E7を抗原とした経口治療ワクチン(GLB101c)は細胞性免疫誘導によるCIN3病変の消退を誘導し、CIN3の新たな内科的治療法として有望である。bortezomib等のプロテアソーム阻害剤はHPV陽性子宮頸がんの新たな治療薬として有望である。MG132のナノミセル内包化剤は高い腫瘍集積性や治療効果が期待され、臨床応用も有望である。レポータ－遺伝子搭載HPVゲノムを複製維持する細胞は複製阻害剤のスクリーニングに有効である。PEG高分子ミセル化したE6 siRNAの全身投与はHPV陽性腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果を示し、核酸医薬の応用が期待される。siRNAのシード領域をDNA修飾したdsRDCや、その一部をRNAに戻したidRNAはオフターゲット効果や細胞毒性がsiRNAより低く核酸治療薬への応用に有用であると考えられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201313011B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ヒトパピローマウイルスを標的とする発がん予防の研究
• 課題番号: H22-３次がん-一般-015
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 温川 恭至(独立行政法人 国立がん研究センター 研究所 ウイルス発がん研究分野)

研究分担者(所属機関)

• 川名　敬(東京大学大学院　医学部　医学系研究科)
• 酒井　博幸(京都大学ウイルス研究所　がんウイルス部門　がん遺伝子研究分野)
• 森　清一郎(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 中川　俊介(帝京大学　医学部　産婦人科)
• 大和　建嗣(筑波大学　医学医療系　消化器内科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 研究代表者交替 清野 透 研究者ID: 2010186356, 所属機関: 独立行政法人国立がん研究センター 研究所 ウイルス発がん研究分野 （平成22年4月1日～平成25年3月31日） ↓ 温川 恭至 （平成25年4月1日以降研究期間終了まで）

研究報告書（概要版）

研究目的

　HPVはほぼ全ての子宮頸がんの原因であり、全がんの5%、 女性のがんの11%の原因となっている。HPV16、18のL1蛋白を抗原とする現行HPV感染予防ワクチンは16、18型以外に対する感染予防効果がないか低い。また、既感染者に対する治療効果は全くない。そこで、発がん性HPV群の感染予防、HPV潜伏感染の阻止、前がん病変の排除等による子宮頸がんの予防法を開発し子宮頸がんの罹患率・死亡率を減少させることが研究の目的である。

研究方法

　HPV型間で共通性の高いL2のアミノ酸56-75(L2-56/75)を抗原に用いることで、全ての型の高リスク型HPVの感染予防が可能な中和抗体を誘導できる可能性が高い。L1とL2-56/75の融合蛋白によるウイルス様粒子(VLP)抗原は製造コストが高いため、新たにL2-56/75をHBs抗原に挿入したキメラ抗原（HBs-56/75）を作成し、中和抗体誘導能を調べた。臨床試験に必要なHPV-DNA検出用のPCRプライマーについて検出精度を調べた。HPV粒子の大量安定供給を可能にする平皿培養細胞を用いた技術開発を進めた。HPV16型E7が細胞表面に提示された乳酸菌製剤（GLBL101c）を作成し、第I/IIa相探索的臨床試験を実施し、安全性、有効性を評価した。
　HPV16、18型のゲノムDNAやゲノムDNAを含む環状DNAをヒト角化細胞にtransfectionしHPV DNAを複製維持する細胞を樹立した。特定のHPV遺伝子に変異を導入して複製への影響を調べた。また、レポーター発現カセットを異なる位置や方向で搭載した環状HPVゲノムを複製・維持する細胞株を樹立し、ゲノムコピー数とレポーター遺伝子の発現量を解析した。
　プロテアソーム阻害剤であるMG132内包ナノミセルやE6特異的siRNAが内包された高分子ミセルのHPV陽性子宮頸がんxenograft腫瘍に対する集積性や増殖抑制効果を調べた。一方、siRNAの細胞毒性を減らすため、DNA-RNAハイブリッド型核酸の改良を進めた。

結果と考察

　L2-56/75領域には少なくとも2つの交差性中和エピトープがあり幅広い型のHPVの中和抗体を誘導できることがわかった。HBVワクチンであるHBs抗原にL2-56/75領域を挿入したキメラ抗原も、交差性HPV中和抗体を効率よく誘導した。HBs/L2キメラ抗原はVLPワクチンに比べ安価に製造でき、発展途上国でも普及可能な感染予防ワクチンとして期待される。
　GLBL101cの至適用量の経口投与により、子宮頸部への抗E7細胞性免疫誘導と80％(8/10)の奏功率が確認された。CIN3に対する内科的治療法として期待できる。
　プロテアソーム阻害剤を内包するナノミセルは、ヌードマウスに移植したHPV陽性の腫瘍細胞への高い集積性と、強い抗腫瘍効果を示した。プロテアソーム阻害剤とシスプラチンとの併用で相乗効果が見られた。E6 siRNA内包高分子ミセルは静脈投与により子宮頸癌担癌マウスに対する抗腫瘍効果を示した。RNA-DNAキメラ型核酸dsRDCやidRNAによってsiRNAの副作用である非特異的細胞増殖抑制効果や毒性を軽減できることを示した。
　HPVゲノムを保持し、HPV感染状態を模したヒト角化細胞や皮膚モデル系を容易に樹立する実験系を開発し、E1ヘリケースは維持複製には不要であることを明らかにした。また、HPVゲノム内にレポーター遺伝子を搭載することで複製阻害剤のハイスループットスクリーニングも可能な細胞株を樹立した。

結論

　L2-56/75領域を抗原とするワクチンは、すべての高リスク型HPVの感染予防が可能なワクチンと成り得る。HBs抗原にHPV16 L2-56/75領域を挿入したキメラ抗原は、幅広い型のHPVとHBVの双方に有効な多価ワクチンとして有望である。一方、HPV16 E7を抗原とし細胞性免疫誘導によるCIN3病変の治療を目指した経口治療ワクチンは探索的第I/IIa相臨床試験の結果、CIN3の新たな内科的治療法として有望である。bortezomib等のプロテアソーム阻害剤を臨床応用につなげる研究の重要性と、MG132のナノミセル内包化剤による臨床応用も有望である。新規HPV複製系を用いた，reverse geneticsによる遺伝子機能解析を行い、E1が維持複製に不要であることを見出した。E6E7を標的にする核酸医薬のナノミセル化により全身投与による抗腫瘍効果が期待される。siRNAのシード領域をDNA修飾したdsRDCや、その一部をRNAに戻したidRNAはオフターゲット効果や細胞毒性がsiRNAより低く核酸治療薬への応用に有用であると考えられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201313011C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: E1ヘリケースがHPVの維持複製には必須でないことを示した。L2-56/75領域には少なくとも2つの交差性中和エピトープがあり幅広い型のHPVの中和抗体を誘導できること、HPV16 L1やHBs抗原にL2-56/75領域を融合したキメラ抗原は、どちらも交差性HPV中和抗体を効率よく誘導した。; E7を抗原とする経口HPVワクチンを開発し第I/IIa相臨床治験にて至適用量では、子宮頸部への抗E7細胞性免疫誘導と80％(8/10)の奏功率が得られた。
• 臨床的観点からの成果: HPV16 L1やHBs抗原にL2-56/75領域を融合したキメラ抗原は、どちらも交差性HPV中和抗体を効率よく誘導し次世代HPV感染予防ワクチンとして有望である。E7を抗原とする経口HPVワクチンはCIN3に対する初の内科的治療薬として有望である。プロテオソーム阻害剤(ベルケード)の子宮頸がんに対する適応拡大を進めるに足る前臨床試験の結果が得られた。
• ガイドライン等の開発: 直接関連する成果はない。
• その他行政的観点からの成果: 現行HPV感染予防ワクチンは高価なため、医薬品輸入超過の一因となっている。また、効果も一部の型に限られているため、子宮頸がん検診への負担はほとんど減らない。HBs/L2キメラ抗原はVLPワクチンに比べ安価に製造でき、成功すればCIN病変の激減と子宮頸がんの完全予防、医療費削減、発展途上国での普及などが期待される。E7を抗原とする経口HPVワクチンはCIN3に対する内科的治療法として期待でき、患者負担、医療費負担を軽減できる治療法として有望である。
• その他のインパクト: 関連学会におけるシンポジウム、ワークショップ、教育セミナー等では多数取り上げられているが、マスコミへの公表等、直接関連する成果はない。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 71件
• その他論文(和文): 1件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 36件
• 学会発表(国際学会等): 9件
• その他成果(特許の出願): 6件 ; 特願2015-017407、 特願PCT/JP2017/000230
• その他成果(特許の取得): 2件 ; 特願2011-268252：特許6002382、 特願PCT/JP2011/079994：特許第6106837
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: プロテアソームインヒビター内包高分子ミセル
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願PCT/JP2010/052556 ; 発明者名: 片岡一則、西山伸宏、Cabral Horacio、宮本雄一郎、中川俊介、松本陽子 ; 権利者名: 片岡一則、西山伸宏、Cabral Horacio、宮本雄一郎、中川俊介、松本陽子 ; 出願年月日: 20100219 ; 国内外の別: 国内外

• 特許の名称: 遺伝子発現阻害剤及び阻害方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2011-268252 ; 発明者名: 大和建嗣、名取幸和 ; 権利者名: 株式会社バイオシンクタンク ; 出願年月日: 20111207 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ヒトパピローマウイルス(HPV)L2蛋白質を認識するモノクローナル抗体とそれを使用したHPV中和抗体価測定法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願PCT/JP2011/079994 ; 発明者名: 森清一郎、神田忠仁 ; 権利者名: 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ; 出願年月日: 20111226 ; 国内外の別: 国内外

• 特許の名称: 粘膜免疫賦活化剤及びHPV感染症治療用経口医薬組成物
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2012-138943 ; 発明者名: 川名敬、田口 歩 ; 権利者名: 国立大学法人東京大学 ; 出願年月日: 20120620 ; 国内外の別: 国内外

• 特許の名称: 遺伝子発現阻害剤及び阻害方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2011-268252 ; 発明者名: 大和建嗣、名取幸和 ; 権利者名: 株式会社バイオシンクタンク ; 出願年月日: 20111207 ; 取得年月日: 20161005 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ヒトパピローマウイルス(HPV)L2蛋白質を認識するモノクローナル抗体とそれを使用したHPV中和抗体価測定法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願PCT/JP2011/079994 ; 発明者名: 森清一郎、神田忠仁 ; 権利者名: 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 ; 出願年月日: 20111226 ; 取得年月日: 20170317 ; 国内外の別: 国内外

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, et al.; Oral immunization with Lactobacillus casei vaccine expressing human papillomavirus (HPV) type 16 E7 is an effective strategy to induce mucosal cytotoxic lymphocyte against HPV16 E7.; Vaccine , 28 (16) , 2810-2817 (2010); 10.1016/j.vaccine.2010.02.005.
• 原著論文2: Satsuka A, Yoshida S, Kajitani N, et al.; Novel human papillomavirus type18 replicon and its application in screening the anti-viral effects of cytokines.; Cancer Science , 101 (2) , 536-542 (2010); 10.1111/j.1349-7006.2009.01411.x.
• 原著論文3: Ishii Y, Tanaka K, Kondo K, et al.; Inhibition of nuclear entry of HPV16 pseudovirus-packaged DNA by an anti-HPV16 L2 neutralizing antibody.; Virology , 406 (2) , 181-188 (2010); 10.1016/j.virol.2010.07.019.
• 原著論文4: Zushi Y, Narisawa-Saito M, Noguchi K, et al.; An in vitro multistep carcinogenesis model for both HPV-positive and -negative human oral squamous cell carcinomas.; American Journal of Cancer Research , 1 (7) , 869-881 (2011)
• 原著論文5: Yamato K, Egawa N, Endo S, et al.; Enhanced specificity of HPV16 E6E7 siRNA by RNA-DNA chimera modification.; Cancer Gene Therapy , 18 (8) , 587-597 (2011); 10.1038/cgt.2011.28.
• 原著論文6: Mori S, Nakao S, Kukimoto I, et al.; Biased Amplification of HPV DNA in Specimens Containing Multiple HPV Types by PCR with Consensus Primers.; Cancer Science , 102 (6) , 1223-1227 (2011); 10.1111/j.1349-7006.2011.01922.x.
• 原著論文7: Egawa N, Nakahara T, Ohno S, et al.; The E1 protein of human papillomavirus type 16 is dispensable for maintenance replication of the viral genome.; Journal of Virology , 86 (6) , 3276-3283 (2012); 10.1128/JVI.06450-11.
• 原著論文8: Narisawa-Saito M, Inagawa Y, Yoshimatsu Y, et al.; A critical role of MYC for transformation of human cells by HPV16 E6E7 and oncogenic HRAS.; Carcinogenesis , 33 (4) , 910-917 (2012); 10.1093/carcin/bgs104.
• 原著論文9: Nakao S, Mori S, Kondo K, et al.; Monoclonal antibodies recognizing cross-neutralization epitopes in human papillomavirus 16 minor capsid protein L2.; Virology , 434 (1) , 110-117 (2012); 10.1016/j.virol.2012.09.006.
• 原著論文10: Taguchi A, Kawana K, Yokoyama T, et al.; Adjuvant effect of Japanese herbal medicines on the mucosal type 1 immune response to human papillomavirus (HPV) E7 in mice immunized orally with Lactobacillus-based therapeutic HPV vaccine in a synergistic manner.; Vaccine , 30 (36) , 5368-5372 (2012); 10.1016/j.vaccine.2012.06.027.
• 原著論文11: Yugawa T, Nishino K, Ohno S, et al.; Noncanonical NOTCH signaling limits self-renewal of human epithelial and induced pluripotent stem cells through ROCK activation.; Molecular and Cellular Biology , 33 (22) , 4434-4447 (2013); 10.1128/MCB.00577-13.
• 原著論文12: Miyamoto Y, Nakagawa S, Wada-Hiraike O, et al.; Sequential effects of the proteasome inhibitor bortezomib and chemotherapeutic agents in uterine cervical cancer cell lines.; Oncology Reports , 29 (1) , 51-57 (2013); 10.3892/or.2012.2072.
• 原著論文13: Kojima S, Kawana K, Tomio K, et al.; The prevalence of cervical regulatory T cells in HPV-related cervical intraepithelial neoplasia (CIN) correlates inversely with spontaneous regression of CIN.; American Journal of Reproductive Immunology , 69 (2) , 134-141 (2013); 10.1111/aji.12030.
• 原著論文14: Mori S, Kusumoto-Matsuo R, Ishii Y, et al.; Replication interference between human papillomavirus types 16 and 18 mediated by heterologous E1 helicases.; Virology Journal , 11 , 1-12 (2014); 10.1186/1743-422X-11-11.
• 原著論文15: Yamamoto M, Onogi H, Kii I, et al.; CDK9 inhibitor FIT-039 prevents replication of multiple DNA viruses.; Journal of Clinical Investigation , 124 (8) , 3479-3488 (2014); 10.1172/JCI73805.
• 原著論文16: Kawana K, Adachi K, Kojima S, et al. et al.; Oral vaccination against HPV E7 for treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN3) elicits E7-specific mucosal immunity in the cervix of CIN3 patients.; Vaccine , 32 (47) , 6233-6239 (2014); 10.1016/j.vaccine.2014.09.020.
• 原著論文17: Taguchi A, Nagasaka K, Kawana K, et al.; Characterization of novel transcripts of human papillomavirus type 16 using CAGE technology.; Journal of Virology , 89 (4) , 2448-2452 (2015); 10.1128/JVI.03433-14.
• 原著論文18: Seiki T, Nagasaka K, Kranjec C, et al.; HPV-16 E6 impairs the subcellular distribution and levels of expression of protein phosphatase 1γ in cervical malignancy.; BMC Cancer , 15 , 230- (2015); 10.1186/s12885-015-1141-0.
• 原著論文19: Nakahara T, Tanaka K, Ohno S, et al. ; Activation of NF-kappaB by Human Papillomavirus 16 E1 Limits E1-Dependent Viral Replication through Degradation of E1.; Journal of Virology , 89 (9) , 5040-5059 (2015); 10.1128/JVI.00389-15.
• 原著論文20: Mori S, Takeuchi T, Ishii Y, et al.; Human Papillomavirus 16 E6 Upregulates APOBEC3B via the TEAD Transcription Factor.; Journal of Virology , 91 (6) , e02413-e02416 (2017); 10.1128/JVI.02413-16.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-09-02
• 更新日: 2018-06-11

収支報告書

• 文献番号: 201313011Z