文献情報
文献番号
201212016A
報告書区分
総括
研究課題名
粘膜型マスト細胞特異的抗体ライブラリを用いたアレルギー・炎症性疾患の早期診断・治療法の開発
課題番号
H23-医療機器-若手-001
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
國澤 純(東京大学 医科学研究所)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究(医療機器[ナノテクノロジー等]総合推進研究)
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成24(2012)年度
研究費
5,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
近年患者数が爆発的に増加しているアレルギー炎症性疾患においてマスト細胞が主要エフェクター細胞の一つとして知られている。本研究では、マスト細胞特異的抗体を用いた新規予防・診断・治療戦略の確立を目指した研究を遂行している。
最近の研究から、免疫学的機能の異なるマスト細胞サブセットの存在が示唆されているが、その特異的分子や分化経路についてはほとんど解明されていない。このような背景のもと、これまでに研究代表者は病態形成に関わるマスト細胞を特異的に識別できる抗体の樹立を試み、現在までに6種類のマスト細胞特異的抗体を樹立することに成功している。本事業においては研究代表者が世界に先駆け独自に樹立した粘膜型マスト細胞特異的抗体の認識分子の同定を進めていくと同時に、食物アレルギーや炎症性腸疾患モデルを用い、治療や予防、診断への応用を進める。これにより、粘膜型マスト細胞の特異性に立脚した早期診断技術と粘膜型マスト細胞を標的とした抗体療法の確立を目指す。
最近の研究から、免疫学的機能の異なるマスト細胞サブセットの存在が示唆されているが、その特異的分子や分化経路についてはほとんど解明されていない。このような背景のもと、これまでに研究代表者は病態形成に関わるマスト細胞を特異的に識別できる抗体の樹立を試み、現在までに6種類のマスト細胞特異的抗体を樹立することに成功している。本事業においては研究代表者が世界に先駆け独自に樹立した粘膜型マスト細胞特異的抗体の認識分子の同定を進めていくと同時に、食物アレルギーや炎症性腸疾患モデルを用い、治療や予防、診断への応用を進める。これにより、粘膜型マスト細胞の特異性に立脚した早期診断技術と粘膜型マスト細胞を標的とした抗体療法の確立を目指す。
研究方法
野生型もしくはP2X7欠損マウス由来の骨髄細胞よりマスト細胞(BMMC)を誘導し、ATP(0.5mM)で刺激した。一部の実験では刺激する際にclone 1F11抗体で処理を行った。刺激後のCD63分子の発現率をフローサイトメトリー法で定量した。
さらにin vivoにおけるマスト細胞上のP2X7の役割を検討する目的で、上記の方法により誘導したBMMCを、マスト細胞欠損マウスに投与しマスト細胞を再構築した。投与3ヶ月後にトリニトロベンゼンスルホン酸の直腸投与による炎症性腸疾患モデルを適用し、マウスの体重変化を測定した。さらにトリニトロベンゼンスルホン酸投与4日後に大腸マスト細胞の活性化を細胞表面でのCD63分子の発現を指標にフローサイトメトリーにて測定した。
健常人、クローン病、潰瘍性大腸炎の腸管組織切片を用い、抗ヒトP2X7抗体と抗マスト細胞抗体による組織染色を行った。
さらにin vivoにおけるマスト細胞上のP2X7の役割を検討する目的で、上記の方法により誘導したBMMCを、マスト細胞欠損マウスに投与しマスト細胞を再構築した。投与3ヶ月後にトリニトロベンゼンスルホン酸の直腸投与による炎症性腸疾患モデルを適用し、マウスの体重変化を測定した。さらにトリニトロベンゼンスルホン酸投与4日後に大腸マスト細胞の活性化を細胞表面でのCD63分子の発現を指標にフローサイトメトリーにて測定した。
健常人、クローン病、潰瘍性大腸炎の腸管組織切片を用い、抗ヒトP2X7抗体と抗マスト細胞抗体による組織染色を行った。
結果と考察
本事業における昨年度の研究から得られた知見をもとに、本年度はclone 1F11の作用機序の解明、ならびにclone 1F11の認識分子であるP2X7の役割について解析を進めた。骨髄由来マスト細胞を用いたin vitroの解析から、clone 1F11で前処理したマスト細胞では、細胞外ATPの刺激による活性化が抑制されること、同様に P2X7欠損マウス由来マスト細胞も細胞外ATPによる活性化が起こらないことを示した。このことから、細胞外ATPはP2X7依存的にマスト細胞を活性化させること、活性化に伴う炎症性サイトカインや脂質メディエーターの産生が、マスト細胞による腸炎増悪化に関与している可能性が示された。
またin vivoにおけるマスト細胞とP2X7の関与を検討する目的で、マスト細胞欠損マウスに野生型もしくはP2X7欠損マスト細胞を再構築した。これらのマウスにTNBS誘導性の炎症性腸疾患モデルを適用したところ、野生型マスト細胞で再構築した群では腸炎の増悪化が観察されたのに対し、P2X7欠損マスト細胞で再構築した群においては腸炎の発症が有意に抑制されていた。さらに、P2X7欠損マスト細胞再構築群において、マスト細胞の活性化率が低下していることも確認した。P2X7はマスト細胞以外にも樹状細胞やT細胞にも発現しているが、今回の結果からマスト細胞を介したATP-P2X7依存的な活性化が炎症性腸疾患の発症における重要な経路であることが示された。
これらの知見をもとに炎症性腸疾患の方の大腸組織でのマスト細胞上のP2X7の発現を確認したところ、クローン病患者の大腸においてマスト細胞のP2X7の発現が増強していた。一方、もう一つの代表的炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎においては、健常人と同様、マスト細胞上にP2X7の発現が認められなかった。このことは少なくともクローン病の発症においてP2X7が関与していること、またマスト細胞上のP2X7の発現を指標にした診断が可能であることを示唆する結果であると考える。マウスのマスト細胞においては、恒常的なP2X7の発現が見られるのに対し、ヒトにおいてはP2X7を発現しないのがデフォルトとなっている。今後、マウスとヒトにおける発現機序の違いを認識しながら、発現制御メカニズムを解明することで、炎症性腸疾患に対する新たな治療戦略が提唱できるものと期待される。
またin vivoにおけるマスト細胞とP2X7の関与を検討する目的で、マスト細胞欠損マウスに野生型もしくはP2X7欠損マスト細胞を再構築した。これらのマウスにTNBS誘導性の炎症性腸疾患モデルを適用したところ、野生型マスト細胞で再構築した群では腸炎の増悪化が観察されたのに対し、P2X7欠損マスト細胞で再構築した群においては腸炎の発症が有意に抑制されていた。さらに、P2X7欠損マスト細胞再構築群において、マスト細胞の活性化率が低下していることも確認した。P2X7はマスト細胞以外にも樹状細胞やT細胞にも発現しているが、今回の結果からマスト細胞を介したATP-P2X7依存的な活性化が炎症性腸疾患の発症における重要な経路であることが示された。
これらの知見をもとに炎症性腸疾患の方の大腸組織でのマスト細胞上のP2X7の発現を確認したところ、クローン病患者の大腸においてマスト細胞のP2X7の発現が増強していた。一方、もう一つの代表的炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎においては、健常人と同様、マスト細胞上にP2X7の発現が認められなかった。このことは少なくともクローン病の発症においてP2X7が関与していること、またマスト細胞上のP2X7の発現を指標にした診断が可能であることを示唆する結果であると考える。マウスのマスト細胞においては、恒常的なP2X7の発現が見られるのに対し、ヒトにおいてはP2X7を発現しないのがデフォルトとなっている。今後、マウスとヒトにおける発現機序の違いを認識しながら、発現制御メカニズムを解明することで、炎症性腸疾患に対する新たな治療戦略が提唱できるものと期待される。
結論
マスト細胞特異的抗体ライブラリを用いた検証から、腸管マスト細胞に強く発現するP2X7が炎症性腸疾患の発症に深く関わっていること、またヒトクローン病においても、マスト細胞でのP2X7の発現が認められたことから、マスト細胞上のP2X7の発現がクローン病における診断や治療標的として有効である可能性が示された。
公開日・更新日
公開日
2013-09-03
更新日
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