ナノマテリアル曝露による慢性影響の効率的評価手法開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 202026007A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ナノマテリアル曝露による慢性影響の効率的評価手法開発に関する研究
• 課題番号: H30-化学-指定-004
• 研究年度: 令和2(2020)年度
• 研究代表者(所属機関): 広瀬 明彦(国立医薬品食品衛生研究所 安全性予測評価部)

研究分担者(所属機関)

• 高橋　祐次(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部・動物管理室)
• 津田　洋幸(公立大学法人　名古屋市立大学　津田特任教授研究室)
• 堀端　克良(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター変異遺伝部)
• 菅野　純(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター 毒性部)
• 渡辺　渡(九州保健福祉大学　生命医科学部)
• 石丸　直澄(徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部（歯学系）)
• 最上　知子(国立医薬品食品衛生研究所　生化学部)
• 小林　憲弘(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)
• 北條　幹(東京都健康安全研究センター　薬事環境科学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成30(2018)年度
• 研究終了予定年度: 令和2(2020)年度
• 研究費: 35,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究はナノマテリアル曝露により最も懸念されている体内蓄積に伴う慢性影響ついてより効率的な定量的リスク評価手法を開発する為に、既に報告されている多層カーボンナノチューブ（MWCNT）のうちのMWNT-7による2年間の慢性吸入試験と同レベルの評価が可能な代替慢性試験法の検討を行うことを目的としている。また、遺伝毒性や免疫影響に関する指標についても今回開発する慢性試験プロトコルへの適用性を検証すると共に、リスク評価に関する国際動向を把握することを目的としている。

研究方法

R2年度は、慢性影響に関する研究として2年間の間欠投与（4週毎に6時間／日曝露）による吸入及び気管内投与による慢性曝露試験を行った。また、短期間気管内噴霧（TIPS）法を用いて長さの異なる二層ナノチューブ曝露による慢性実験を行いその発がん性を評価した。慢性影響指標に関する研究としては、最適化した肺小核試験法を用いてMWCNT-7 気管内投与における遺伝毒性評価を実施した。さらに、MWNT-7の2年間の間欠吸入曝露で得られたサンプルを用いた免疫ネットワーク解析、MWCNT-7の複数回吸入曝露による感染性免疫系への影響解析、in vitro系を用いたIL-1β分泌におけるスカベンジャー受容体MSR1の解析に関する研究を行った。海外動向調査としては、OECDナノマテリアル作業グループの最新動向を調査した。

結果と考察

慢性影響に関する研究に関して、2年間の慢性吸入毒性試験と同レベルの肺内負荷量を達成するために開発した2年間の間欠曝露試験を行い、曝露開始24ヵ月の最終期解剖を実施した。各群に死亡率の差は認められなかったが、肺の外観においては曝露濃度依存的に灰白色から灰色を呈して腫大し、肺重量が増加していた。肉眼的観察において曝露群の2例に肺がんを示唆する病変が観察された。気管内投与については、ラット気管内投与については、Taquann処理MWNT-7を4週間に1度、2年間にわたり投与した結果、肺負荷量は低用量群で約900 µg/Lung、高用量群で3600 µg/Lungに達し、用量依存的に肺腫瘍および胸膜中皮腫が発症した。短期間気管内噴霧（2週8回投与）＋慢性観察（TIPS）法による長さの異なる二層ナノチューブ曝露による慢性影響試験を実施し、肺がんの誘発性が強さが繊維長に依存しないことを明らかにした。慢性影響指標に関する研究では、遺伝毒性指標としてマウスでのin vivo肺小核試験遺伝毒性試験における陽性対照の適用性および採材時期の最適化を検証中し、それを用いてMWCNT-7気管内投与下での遺伝毒性評価を実施した結果、肺小核試験で陽性となることを示した。免疫ネットワークへの影響では、MWCNT-7の吸入曝露の長期暴露（24ヶ月）後の肺胞マクロファージの割合が高濃度のMWCNT-7暴露で増加すると共に全身のマクロファージ分化にも影響が生じることが示された。加えて、in vitroおよび慢性腹膜炎モデルの系によりMMP-12を介した慢性炎症の機転が示された。感染性に対する影響では、Taquann法によるMWNT-7の複数回吸入曝露後のRSV感染マウスへの回復期（感染21日後）での影響を検討した結果、RSV感染のみでは肺炎はほぼ終息していたのに対して、MWNT-7曝露マウスではカーボン貪食マクロファージの集束など明確な肺炎像が認められた。特に高用量曝露で顕著であり、肺炎マーカーの上昇をよく反映した結果が得られた。In vitroメカニズム解析研究では、MWCNTによるNLRP3インフラマソームを介する炎症応答へのスキャベンジャー受容体MSR1の関与を解析し、特定サイズのMWCNTによるIL-1産生への部分的関与を明らかにした。海外動向調査では、OECD工業用ナノ材料作業部会（WPMN）等の国際会合に参加して，ナノ材料に関する最新の国際動向を調査し、WPMNにおいて先端材料（Advanced materials）を検討対象としているが，Advanced materialsの定義に関する情報が不足している他，有害性，使用実態，曝露に関する情報のデータギャップがナノ材料よりも大きく，今後も継続的に情報収集を行う必要があると考えられた。

結論

間欠曝露型の吸入及び気管内投与の慢性実験について、曝露実験を終了することができ、2年間の連続吸入曝露と同程度の催腫瘍性を間欠曝露でも得ることができた。しかし、中皮の増殖影響は気管内投与でより強く、肺がんの誘発とは異なるメカニズムが示唆された。また、肺がんの誘発性には繊維の長さがあまり影響しないことも示された。今後は、より短期の間欠投与の試験系を確立すると共に、中皮腫と肺がんを区別してリスク評価する為の指標や曝露手法の開発が必要であることが明らかとなった。

公開日・更新日

• 公開日: 2021-11-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 202026007B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: ナノマテリアル曝露による慢性影響の効率的評価手法開発に関する研究
• 課題番号: H30-化学-指定-004
• 研究年度: 令和2(2020)年度
• 研究代表者(所属機関): 広瀬 明彦(国立医薬品食品衛生研究所 安全性予測評価部)

研究分担者(所属機関)

• 高橋　祐次(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部・動物管理室)
• 津田　洋幸(公立大学法人　名古屋市立大学　津田特任教授研究室)
• 堀端　克良(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター変異遺伝部)
• 菅野　純(国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター 毒性部)
• 渡辺　渡(九州保健福祉大学　生命医科学部)
• 石丸　直澄(徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部（歯学系）)
• 最上　知子(国立医薬品食品衛生研究所　生化学部)
• 小林　憲弘(国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部)
• 北條　幹(東京都健康安全研究センター　薬事環境科学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成30(2018)年度
• 研究終了予定年度: 令和2(2020)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究はナノマテリアル曝露により最も懸念されている体内蓄積に伴う慢性影響ついてより効率的な定量的リスク評価手法を開発する為に、既に報告されている多層カーボンナノチューブ（MWCNT）のうちのMWNT-7による2年間の慢性吸入試験と同レベルの評価が可能な代替慢性試験法の検討を行うことを目的としている。また、遺伝毒性や免疫影響に関する指標についても今回開発する慢性試験プロトコルへの適用性を検証すると共に、リスク評価に関する国際動向を把握することを目的としている。

研究方法

慢性影響に関する研究として2年間の慢性吸入毒性試験と同レベルの肺内負荷量を達成するために2年間の間欠投与（4週毎に6時間／日曝露）による吸入及び気管内投与による慢性曝露試験を行った。また、短期間気管内噴霧（TIPS）法によるチタン酸カリウムと長さの異なる二層ナノチューブ曝露を用いた慢性実験を行った。慢性影響指標に関して、最適化した肺小核試験法によりMWCNT-7 気管内投与における遺伝毒性試験を行った。さらに、MWNT-7の2年間の間欠吸入曝露試験における免疫ネットワーク解析、MWNT-7の吸入曝露による感染性免疫系への影響解析、インフラマソーム依存的なマクロファージのIL-1β分泌活性化のin vitroメカニズム解析を行った。海外動向調査としては、OECDナノマテリアル作業グループの最新動向を調査した。

結果と考察

慢性影響に関する研究に関して、代替試験法として2年間の慢性吸入毒性試験と同レベルの肺内負荷量を達成するために間欠型曝露の慢性観察試験のプロトコルを確立し、2年間のMWNT-7間欠曝露試験を行った。Taquann全身曝露吸入装置を用いた吸入曝露実験については、マウスを使用し、曝露6ヵ月、1年目の中間定期解剖と2年目の最終定期解剖を実施した。対照群（C群）、低濃度群（L群）、高濃度群（H群）の3群構成で試験を実施し、26回/2年間の平均質量濃度はL群、H群それぞれ2.7±0.1 mg/m3、5.2±0.2 mg/m3、MMADは400～500nmと考えられた。群間に死亡率の差は認められなかったが、肺の外観は曝露濃度依存的に灰白色から灰色を呈して腫大し、肺重量が増加した。肉眼的観察においてL群に2例に肺がんを示唆する病変がみられた。ラットの2年間の間欠気管内投与の結果は、高用量群では肺腫瘍と胸膜中皮腫の発現率が有意に増加した。TIPS法によるチタン酸カリウムの曝露（104週後）で肺胞上皮過形成・腺腫・腺がんの合計および胸膜中皮過形成と悪性中皮腫の合計頻度において有意な増加が見られた。長さが1.5、7.0および15μmのDWCNT曝露による肺発がんの誘発性には有意な違いは認められ無かった。慢性影響指標に関する研究では、MWCNT-7の遺伝毒性指標としては、先行研究に基づいて肺小核試験法を最適化し、マウスin vivo肺小核試験遺伝毒性試験を行ったところ、MWCNT-7気管内投与では陽性となることを明らかにした。免疫ネットワークへの影響については、MWCNT-7の全身吸入曝露の慢性影響として、肺胞マクロファージの分化、成熟が大きく変化するとともに、マクロファージを介した線維化に至る慢性炎症の分子機序が示された。感染性に対する影響では、MWNT-7の単回吸入曝露では明確でなかった急性期での影響が、複数回曝露により肺炎マーカーCCL5および線維化マーカーTGF-βの上昇で認められ、回復期では明確な肺炎増悪化として明らかとなった。急性期で上昇する肺炎マーカー等が肺炎増悪化への感染影響指標となることが判明した。In vitroメカニズム解析研究では、様々なナノマテリアルによるNLRP3インフラマソームを介する炎症応答にスタチンによる抑制効果のあることが認められ、その効果が酸化チタンやMWCNT等の物性の違いにより異なることを見いだした。海外動向調査では、OECDのナノマテテリアル作業グループ（WPMN）において、本研究班で検証している短期曝露による慢性観察試験法の有用性の紹介を行った。また、新規の先端材料に関するリスク評価の問題や，粒子サイズ分布の計測ガイドラインに関する情報収集を実施した。

結論

間欠曝露型の吸入及び気管内投与の慢性実験について、曝露実験を終了することができ、2年間の連続吸入曝露と同程度の催腫瘍性を間欠曝露でも得ることができた。しかし、中皮の増殖影響は気管内投与でより強く、肺がんの誘発とは異なるメカニズムが示唆された。また、肺がんの誘発性には繊維の長さがあまり影響しないことも示された。今後は、より短期の間欠投与の試験系を確立すると共に、中皮腫と肺がんを区別してリスク評価する為の指標や曝露手法の開発が必要であることが明らかとなった。

公開日・更新日

• 公開日: 2021-11-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 202026007C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 多層カーボンナノチューブによる2年間の慢性連続吸入毒性試験の結果と同等の結果を得るための曝露回数を少なくした間欠型の慢性曝露実験のプロトコルを開発した。肺負荷量を基に腫瘍の誘発性を比較したところ、慢性連続吸入毒性試験と同レベルの催腫瘍性を示すことができた。吸入曝露法と気管内投与法で得られた結果より、投与方法の違いによる誘発腫瘍プロファイルの違いも比較することが可能となった。今後、曝露手法をさらに省力化し、より効率的な慢性吸入毒性試験法を開発する為の有用な知見が得られたと考えられる。
• 臨床的観点からの成果: 先行研究ではアスベスト様の形状の多層カーボンナノチューブの気管内投与により、中皮腫と肺がんを誘発することを明らかにしていたが、2年間の吸入曝露試験では肺がんの誘発しか認められていなかった。本研究による間欠型の慢性曝露試験でも同様の結果が得られ、曝露手法の違いにより腫瘍プロファイルが異なることが示された。線維状粒子の吸入曝露による催腫瘍性に対する評価として、曝露手法等を考慮した臨床的な解析も今後必要になることを示唆したものであると考えられる。
• ガイドライン等の開発: 本研究斑で開発された間欠型の慢性曝露試験をさらに発展させた短期間の間欠曝露で行う慢性毒性試験を開発し、現状において唯一の標準的試験法である2年間の連続吸入曝露試験を代替できる試験法の提案をISOの技術文書としての提案をしている。最初のステップとして計画案がTC229のWG3会議 （2021年5月）で認められ、2023年11月のTC229の定期会議で本計画採択に向けた議論を継続している（2023年6月）。
• その他行政的観点からの成果: 多種のカーボンナノチューブに限らず様々なナノマテリアルの健康影響評価において、すべての物質で慢性吸入曝露試験を行うのは実質的に不可能であるが、現実的には指針値等の設定のためには、この吸入試験法は必須でもある。今回の研究班では間欠曝露でも連続吸入曝露による慢性試験と同レベルの結果を出すことを明らかにすることができ、最終的な目標であるところの行政的に必要とされる慢性吸入実験を効率的に行うことのできる試験法の開発にむけた最初のステップとして成功したものと考えられる
• その他のインパクト: Nano Tech 2021 第20回 国際ナノテクノロジー総合展・技術会議においてナノテクビジネス協議会（NBCI）主催の「第13回国際団体会議」( The 13th Nano Tech Association Conference)」において、当研究班で実施および計画している新規の慢性吸入試験法について紹介（英語）を行った。（東京ビックサイト（Web同時開催）：2020年12月10日）

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 14件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 37件
• 学会発表(国際学会等): 27件
• その他成果(特許の出願): 2件
• その他成果(特許の取得): 2件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 吸入曝露試験用カートリッジ、試験物質供給装置及び吸入曝露試験装置
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2018-81836 ; 発明者名: 柴田眞利、菅野 純、生田達也、鶴田祐吾、髙橋祐次 ; 権利者名: 柴田科学株式会社、国立医薬品食品衛生研究所長 ; 出願年月日: 20190420 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 試験物質供給装置及び吸入曝露試験装置
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 2018-81837 ; 発明者名: 菅野 純、生田達也、鶴田祐吾、髙橋祐次 ; 権利者名: 国立医薬品食品衛生研究所長 ; 出願年月日: 20190420 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 吸入曝露試験用カートリッジ，試験物質供給装置及び吸入曝露試験装置
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 7112685 ; 発明者名: 柴田眞利，菅野純，生田達也，鶴田祐吾，髙橋祐次 ; 権利者名: 柴田眞利，菅野純，生田達也，鶴田祐吾，髙橋祐次 ; 出願年月日: 20180420 ; 取得年月日: 20220727 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 試験物質供給装置及び吸入曝露試験装置
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 7111296 ; 発明者名: 柴田眞利，菅野純，生田達也，鶴田祐吾，髙橋祐次 ; 権利者名: 柴田眞利，菅野純，生田達也，鶴田祐吾，髙橋祐次 ; 出願年月日: 20180420 ; 取得年月日: 20220725 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Sakamoto Y, Hojo M, Kosugi Y, et al.; Comparative study for carcinogenicity of 7 different multi-wall carbon nanotubes with different physicochemical characteristics by a single intraperitoneal injection in male Fischer 344 rats.; J Toxicol Sci. , 43 (10) , 587-600 (2018); 10.2131/jts.43.587
• 原著論文2: Abdelgied M., Elgazzar AM., Alexander D., et al.; Pulmonary and pleural toxicity of potassium octatitanate fibers, rutile titanium dioxide nanoparticles, and MWCNT-7 in male Fischer 344 rats; Arch. Toxicol., , 93 (4) , 909-920 (2019); 10.1007/s00204-019-02410-z
• 原著論文3: Abdelgied M., Elgazzar AM., Alexander TW., et al.; Carcinogenic effect of potassium octatitnate (POT) fibers in the lung and pleura of male Fischer 344 rats after intrapulmonary administration,; Particle and Fibre Toxicology. , 16 (34) (2019); 10.1186/s12989-019-0316-2
• 原著論文4: Saleh DM, Alexander WT, Numano T, et al.; Comparative carcinogenicity study of a thick, straight-type and a thin, tangled-type multi-walled carbon nanotube administered by intra-tracheal instillation in the rat.; Part Fibre Toxicol. , 17 (1) , 48- (2020); 10.1186/s12989-020-00382-y
• 原著論文5: Cui H, Soga K, Tamehiro N, et al.; Statins repress needle-like carbon nanotube- or cholesterol crystal-stimulated IL-1β production by inhibiting the uptake of crystals by macrophages,; Biochem Pharmacol. , 188 , 114580- (2021); 10.1016/j.bcp.2021.114580
• 原著論文6: Maeno A, Sakamoto Y, Hojo M, Tada Y, Suzuki J, Inomata A, Moriyasu T, Hirose A, Kemuriyama N, Miyaji; A case of spontaneous Zymbal's gland carcinoma with lung metastasis in an aged Fischer 344 rat.; J. Toxic. Pathol. , 34 (3) , 353-358 (2021); https://doi.org/10.1293/tox.2021-0013
• 原著論文7: Hojo M, Yamamoto Y, Sakamoto Y, Maeno A, Ohnuki A, Suzuki J, Inomata A, Moriyasu T, Taquahashi Y, Ka; Histological sequence of the development of rat mesothelioma by MWCNT, with the involvement of apolipoproteins.; Cancer Sci. , 112 (6) , 2021- (2021); https://doi.org/10.1111/cas.14873
• 原著論文8: Horibata K, Takasawa H, Hojo M, Taquahashi Y, Shigano M, Yokota S, Kobayashi N, Sugiyama KI, Honma M; In vivo genotoxicity assessment of a multiwalled carbon nanotube in a mouse ex vivo culture.; Genes Environ. , 44 , 24- (2022); https://doi.org/10.1186/s41021-022-00253-2
• 原著論文9: Hojo M, Maeno A, Sakamoto Y, Ohnuki A, Tada Y, Yamamoto Y, Ikushima K, Inaba R, Suzuki J, Taquahashi; Two-year intermittent exposure of a multiwalled carbon nanotube by intratracheal instillation induces lung tumors and pleural mesotheliomas in F344 rats.; Part Fibre Toxicol. , 19 , 38- (2022); https://doi.org/10.1186/s12989-022-00478-7
• 原著論文10: Saleh D., Luo S., Ahmed HM Omnia, Alexander DB., Alexander TW., Gunasekaran S., El-gazzar AM., Abdel; Assessment of the toxicity and carcinogenicity of double-walled carbon nanotubes in the rat lung after intratracheal instillation: a two-year study.; Particle and Fibre Toxicol. , 19時 , 30- (2022); https://doi.org/10.1186/s12989-022-00469-8

公開日・更新日

• 公開日: 2021-11-02
• 更新日: 2023-07-28

収支報告書

• 文献番号: 202026007Z
• 報告年月日: 2022年01月26日

収入

• (1)補助金交付額: 35,000,000円
• (2)補助金確定額: 34,809,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 191,000円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	18,580,599円
		人件費・謝金	4,117,475円
		旅費	26,984円
		その他	12,084,183円
	間接経費		0円
	合計		34,809,241円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2023-07-28
• 更新日: -