文献情報
文献番号
200200950A
報告書区分
総括
研究課題名
胎生期の水銀およびカドミウム曝露による神経行動毒性の高感受性群におけるリスク評価に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関)
渡辺 知保(東京大学大学院医学系研究科)
研究分担者(所属機関)
- 吉田稔(聖マリアンナ医科大学)
- 佐藤雅彦(岐阜薬科大学)
- 島田章則(鳥取大農学部)
- 吉田克巳(東北大学大学院医学系研究科)
- 今井秀樹(国立環境研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品・化学物質安全総合研究
研究開始年度
平成14(2002)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
26,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究は,マウス胎生期におけるメチル水銀およびカドミウムへの曝露が生後の中枢神経機能に及ぼす影響を,特に感受性が高いと考えられる幼若期および老齢期に焦点をあて,高感度かつ多角的な行動機能試験を用いて検討し,現実のヒトにおける健康リスクの評価に資することを目的としている.遺伝的な管理が進んでいるマウスを用い,両金属について,金属への胎生期微量長期曝露を行ない,出生後(老齢期を含めて)に神経・行動毒性とそのメカニズムについて評価するとともに,遺伝的,生理的,環境的な感受性要因による毒性の修飾について検討する.本研究の結果は,日本人の食生活の安全性を考えるうえで重要なこれら2つの重金属への微量曝露の健康リスク評価について,その精度を高めると同時に,高感受性集団を同定することにより対策におけるプライオリティの決定にも貢献することを目指す
研究方法
本年度は以下の研究を行った.なお,実験動物には原則としてC57BL/6J系マウス,およびこの系統を野生型とするメタロチオネインI/II欠損(MTKO)マウスを用いた.
1.陽性対照としてのジエチルスチルベストロール(DES)の周産期曝露がマウスの行動に及ぼす影響では,本研究全体のエンドポイントとなる各種行動試験における陽性対照として,周生期DES曝露を用いることの適否ならびに問題点を検討した. C57BL/6J系統のみを用い,周生期低レベルDES曝露の行動影響を,オープンフィールド試験ならびに受動回避試験,性行動・攻撃行動について調べた.また,α型女性ホルモン受容体発現ならびにドパミン細胞の発現を免疫染色を用い,関連する神経核について視床下部領域を中心に評価した.
2.長期低濃度水銀曝露の行動影響 メチル水銀毒性の感受性要因として設定した水銀蒸気への離乳後曝露による行動影響を検討した. 野生型およびMTKOの双方について,従来の実験に比べ低濃度の水銀蒸気(40～200μg/cu m)長期間(8時間/日で5ヶ月)の曝露を実施し,曝露3および5ヶ月において,オープンフィールド試験ならびに受動回避試験を.
3.胎生期および授乳期カドミウム経口曝露によるカドミウムの体内動態並びに行動機能に及ぼすメタロチオネインの影響 カドミウム胎生期曝露については基礎的情報が欠落しているため.Cd 10,50ppmを含む水で妊娠マウスを飼育し,胎仔移行など基礎情報について検討した.また MTKOと野生型C57BL/6Jとで結果を比較し,胎仔移行におけるMTの役割について考察した.
4.低濃度長期水銀曝露マウス脳の分子病理学的変化に関する研究 項目2における5ヶ月間水銀曝露の動物の脳を用い,大脳・小脳・脳幹にまたがる6レベル(等間隔の前額断切片)で標本を作製・観察した.autoradiography による水銀沈着の観察,ならびにHE,TUNEL,GFAP,ルクソールブルー染色などに一般的な神経組織の病理染色を試みた.
5.水銀あるいはカドミウムへの周生期曝露に対する生理的感受性要因(甲状腺ホルモン系); 甲状腺ホルモンの代謝に重要な役割を持つ,ヨードチロニン脱ヨード酵素は重金属と相互作用することが知られるセレンを含むタンパク質であり,HgやCdは,この酵素への影響を介して,甲状腺ホルモン環境に影響を与える可能性がある.本年度はこの酵素の胎仔から新生仔期にかけての変化と,新生仔期脳の酵素活性にHgやCdが及ぼす影響をin vitro で検討した.
6.水銀あるいはカドミウムへの周生期曝露に対する生理的感受性要因(視床下部-下垂体-副腎系)トリメチルスズによる海馬の選択的傷害モデルにおいて,グルココルチコイドによる傷害の修飾を,副腎摘出ならにデキサメタゾン投与を併用した場合と比較することにより,組織病理・免疫組織化学を用いて評価した.
1.陽性対照としてのジエチルスチルベストロール(DES)の周産期曝露がマウスの行動に及ぼす影響では,本研究全体のエンドポイントとなる各種行動試験における陽性対照として,周生期DES曝露を用いることの適否ならびに問題点を検討した. C57BL/6J系統のみを用い,周生期低レベルDES曝露の行動影響を,オープンフィールド試験ならびに受動回避試験,性行動・攻撃行動について調べた.また,α型女性ホルモン受容体発現ならびにドパミン細胞の発現を免疫染色を用い,関連する神経核について視床下部領域を中心に評価した.
2.長期低濃度水銀曝露の行動影響 メチル水銀毒性の感受性要因として設定した水銀蒸気への離乳後曝露による行動影響を検討した. 野生型およびMTKOの双方について,従来の実験に比べ低濃度の水銀蒸気(40～200μg/cu m)長期間(8時間/日で5ヶ月)の曝露を実施し,曝露3および5ヶ月において,オープンフィールド試験ならびに受動回避試験を.
3.胎生期および授乳期カドミウム経口曝露によるカドミウムの体内動態並びに行動機能に及ぼすメタロチオネインの影響 カドミウム胎生期曝露については基礎的情報が欠落しているため.Cd 10,50ppmを含む水で妊娠マウスを飼育し,胎仔移行など基礎情報について検討した.また MTKOと野生型C57BL/6Jとで結果を比較し,胎仔移行におけるMTの役割について考察した.
4.低濃度長期水銀曝露マウス脳の分子病理学的変化に関する研究 項目2における5ヶ月間水銀曝露の動物の脳を用い,大脳・小脳・脳幹にまたがる6レベル(等間隔の前額断切片)で標本を作製・観察した.autoradiography による水銀沈着の観察,ならびにHE,TUNEL,GFAP,ルクソールブルー染色などに一般的な神経組織の病理染色を試みた.
5.水銀あるいはカドミウムへの周生期曝露に対する生理的感受性要因(甲状腺ホルモン系); 甲状腺ホルモンの代謝に重要な役割を持つ,ヨードチロニン脱ヨード酵素は重金属と相互作用することが知られるセレンを含むタンパク質であり,HgやCdは,この酵素への影響を介して,甲状腺ホルモン環境に影響を与える可能性がある.本年度はこの酵素の胎仔から新生仔期にかけての変化と,新生仔期脳の酵素活性にHgやCdが及ぼす影響をin vitro で検討した.
6.水銀あるいはカドミウムへの周生期曝露に対する生理的感受性要因(視床下部-下垂体-副腎系)トリメチルスズによる海馬の選択的傷害モデルにおいて,グルココルチコイドによる傷害の修飾を,副腎摘出ならにデキサメタゾン投与を併用した場合と比較することにより,組織病理・免疫組織化学を用いて評価した.
結果と考察
1.陽性対照としてのDES DES曝露により,受動的回避試験成績は用量依存的に抑制,オープンフィールドでは活動亢進を認めたほか,オスの性行動,攻撃行動についても亢進を認めた.個体レベルで検討したところ,オープンフィールドの活動亢進と性行動・攻撃行動との間には正の相関が見られた.また,オスにおいてERαの発現が腹内側核(視床下部 jで増加するとの結果を得た.
2.水銀曝露の行動影響 Hg曝露3あるいは5ヶ月の時点で,オープンフィールドでの活動量亢進や受動回避学習における成績の低下を認めた.MTKO群で,脳を含めて組織中Hg濃度が野生型より低いにもかかわらず,Hgによる行動影響は対照群に比べて顕著であったことは,水銀の神経毒性に対するMTの役割を考えるうえで重要な知見である.
3.カドミウムの胎仔移行 胎生期曝露においてCdは胎仔に移行することが示された.MTKOでは母体の腎Cdが野生型より低かったが,母体肝・脳・胎盤,胎仔肝・脳でもCd濃度が野生型より高く,母体の腎MTが胎仔へのCdの移行の制御に重要な役割を示すことが判明した. Cdによる出生後の体重増加の抑制はMTKOマウスにおいて顕著であった.
4.水銀曝露の分子病理 曝露群では,水銀の微粒子が脳の広範な部位において大型のニューロンの細胞質に見いだされた.これは,水銀蒸気曝露が低濃度で長期にわたる条件において水銀が神経繊維連絡に沿った移行経路で脳に侵入することを示唆するとも考えられた.一般的な病理検索では脳に病変は認められず,グリア活性化,アポトーシス誘導,あるいはMT(-I,II)誘導を示唆する所見は得られなかった.
5.感受性要因としての甲状腺ホルモン 脳に発現する2つのタイプの脱ヨード酵素のうち,タイプ2は,在胎期終盤から出生後にかけて急速に活性があがってくること,一方でタイプ3は出生後2-3日に高値を示すという,ラットで知られているパターンとよく一致した.In vitro での添加実験の結果から,メチル水銀は神経組織に対する直接的な毒性に加え,タイプ2脱ヨード酵素活性を抑制することにより脳の発育を妨げる可能性が示唆された.
6.感受性要因としてのHP Axis TMTによる海馬障害が,グルココルチコイドを修飾することによって軽減あるいは増悪されることがわかった.異なるサブタイプのグルココルチコイド受容体が全く正反対の役割を果たすことを見いだした.
2.水銀曝露の行動影響 Hg曝露3あるいは5ヶ月の時点で,オープンフィールドでの活動量亢進や受動回避学習における成績の低下を認めた.MTKO群で,脳を含めて組織中Hg濃度が野生型より低いにもかかわらず,Hgによる行動影響は対照群に比べて顕著であったことは,水銀の神経毒性に対するMTの役割を考えるうえで重要な知見である.
3.カドミウムの胎仔移行 胎生期曝露においてCdは胎仔に移行することが示された.MTKOでは母体の腎Cdが野生型より低かったが,母体肝・脳・胎盤,胎仔肝・脳でもCd濃度が野生型より高く,母体の腎MTが胎仔へのCdの移行の制御に重要な役割を示すことが判明した. Cdによる出生後の体重増加の抑制はMTKOマウスにおいて顕著であった.
4.水銀曝露の分子病理 曝露群では,水銀の微粒子が脳の広範な部位において大型のニューロンの細胞質に見いだされた.これは,水銀蒸気曝露が低濃度で長期にわたる条件において水銀が神経繊維連絡に沿った移行経路で脳に侵入することを示唆するとも考えられた.一般的な病理検索では脳に病変は認められず,グリア活性化,アポトーシス誘導,あるいはMT(-I,II)誘導を示唆する所見は得られなかった.
5.感受性要因としての甲状腺ホルモン 脳に発現する2つのタイプの脱ヨード酵素のうち,タイプ2は,在胎期終盤から出生後にかけて急速に活性があがってくること,一方でタイプ3は出生後2-3日に高値を示すという,ラットで知られているパターンとよく一致した.In vitro での添加実験の結果から,メチル水銀は神経組織に対する直接的な毒性に加え,タイプ2脱ヨード酵素活性を抑制することにより脳の発育を妨げる可能性が示唆された.
6.感受性要因としてのHP Axis TMTによる海馬障害が,グルココルチコイドを修飾することによって軽減あるいは増悪されることがわかった.異なるサブタイプのグルココルチコイド受容体が全く正反対の役割を果たすことを見いだした.
結論
本年度各検討より得られた結論は以下のようにまとめられる.
・DESは多くの行動試験でpositiveな結果を得ることができた一方で,親には検出できるような影響を及ぼさなかったことから,仔の神経行動機能に比較的特異的に影響を及ぼす処理として有用であると考えられた.
・水銀蒸気の長期低濃度曝露は,従来の実験の中でも最も低い濃度で実施されており,そこで行動異常を検出できた意義は大きい.また,MTが水銀の神経毒性に対して防御的に働く可能性も示唆され,これを感受性要因として検討する根拠を得ることができた.
・カドミウムにおいては,胎仔移行が確認された他, MTKOと野生型とのCd蓄積や体重増加のデータ
により,MTがF1世代への影響についても感受性要因となる可能性が示唆された.
・水銀曝露動物の分子病理学的検討では,水銀粒子の沈着のデータから,今回のような曝露条件における水銀の移行が神経連絡と関連する可能性が示唆された.また行動学的変化(吉田稔氏)が,顕著な神経学的病変を伴わずに起こっていることが判明した.
・胎仔～新生仔の脳における甲状腺ホルモン制御酵素活性が,ラットで知られるパターンと類似し,生理的に考えて合理的な変化を示すことが確認された.また,in vitroの系では水銀が酵素活性に対して直接的な阻害作用を示すことが確認された.
・HPAaxis系については,神経障害の程度がグルココルチコイドのレベルに依存する場合があることが明らかになった.こうした修飾が,メチル水銀・カドミウムの場合にも起こりえるのか,また周生期においてグルココルチコイドが神経毒性を修飾するのかという点が今後の課題である.
・DESは多くの行動試験でpositiveな結果を得ることができた一方で,親には検出できるような影響を及ぼさなかったことから,仔の神経行動機能に比較的特異的に影響を及ぼす処理として有用であると考えられた.
・水銀蒸気の長期低濃度曝露は,従来の実験の中でも最も低い濃度で実施されており,そこで行動異常を検出できた意義は大きい.また,MTが水銀の神経毒性に対して防御的に働く可能性も示唆され,これを感受性要因として検討する根拠を得ることができた.
・カドミウムにおいては,胎仔移行が確認された他, MTKOと野生型とのCd蓄積や体重増加のデータ
により,MTがF1世代への影響についても感受性要因となる可能性が示唆された.
・水銀曝露動物の分子病理学的検討では,水銀粒子の沈着のデータから,今回のような曝露条件における水銀の移行が神経連絡と関連する可能性が示唆された.また行動学的変化(吉田稔氏)が,顕著な神経学的病変を伴わずに起こっていることが判明した.
・胎仔～新生仔の脳における甲状腺ホルモン制御酵素活性が,ラットで知られるパターンと類似し,生理的に考えて合理的な変化を示すことが確認された.また,in vitroの系では水銀が酵素活性に対して直接的な阻害作用を示すことが確認された.
・HPAaxis系については,神経障害の程度がグルココルチコイドのレベルに依存する場合があることが明らかになった.こうした修飾が,メチル水銀・カドミウムの場合にも起こりえるのか,また周生期においてグルココルチコイドが神経毒性を修飾するのかという点が今後の課題である.
公開日・更新日
公開日
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更新日
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