文献情報
文献番号
200000526A
報告書区分
総括
研究課題名
節足動物媒介性ウイルスに対する診断法の確立、疫学およびワクチン開発に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
倉根 一郎(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 安居院宣昭(国立感染症研究所)
- 小西英二(神戸大学)
- 高島郁夫(北海道大学)
- 只野昌之(琉球大学)
- 名和 優(埼玉医科大学)
- 森田公一(長崎大学)
- 山岡正興(兵庫県立衛生研究所)
- 山田章雄(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
26,100,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
現在、日本国内で感染しうる節足動物媒介性ウイルスは、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスのみと考えられている。しかし、世界的にみれば節足動物媒介性ウイルスは数十種のウイルスがヒトに感染し病気をおこすことが知られており、デングウイルスや黄熱ウイルスのように海外において毎年多数の感染者が発生し、さらに致死的であるものも多い。近年、海外旅行者の増加に伴い、デング熱等に見られるように海外旅行中に感染し帰国後発症するいわゆる輸入感染症として診断されている症例があるが、診断されずに見逃されている例もあると考えられる。一方、1999年にアメリカ合衆国でみられた西ナイル脳炎のように、過去国内に存在しない節足動物媒介性ウイルス感染症が出現する可能性も存在する。これら輸入感染症あるいは輸入感染症として国内に侵入する可能性のある節足動物媒介性ウイルスに対して診断法を確立しておくこと、これらのウイルス感染症の日本国内における状況を血清、病原体、ベクターの面から把握することが重要である。一方、ワクチンに関しては現行ワクチンにはない特徴をもつ新形ワクチン開発の意義は大きい。本研究は3つの目的を有する。日本に侵入する可能性のある節足動物媒介性ウイルスに対して、血清診断法と病原体診断法を確立する。節足動物媒介性ウイルスの国内における感染状況を病原体およびベクターの両面から把握する。節足動物媒介性ウイルスに対する新型ワクチンの開発に向けて、動物実験を含めた基礎的研究を行う。
研究方法
(1)単クローン抗体の作製は北海道分離ウイルスOshima株をホルマリンで不活化しマウスを免疫した。常法に従いハイブリドーマを得た。産生抗体を間接蛍光抗体法にてスクリーニングした。(2)IgM-ELISA法は以下のように行った。固相に抗ヒトIgM抗体を被覆しておき、ここへ患者血清を反応させた。ウイルス抗原(P)と正常非感染抗原(N)とを別々に加えて、固相に捕捉されたデングウイルス特異的IgM抗体と反応させた。デングウイルス特異的IgM抗体と反応したウイルス抗原を、酵素標識した単クローン抗体D1-4G2により検出した。(3)NS1抗体測定法は平成11年度上記研究班の分担研究報告書に記載した方法にそって行った。(4)プラスミドpcJEMEは、pcDNA3ベクターに、JEVのprM及びE遺伝子を組込んだものである。また同遺伝子をpNGVL4aベクターに挿入して得られたpNJEMEのDNAを精製し、ワクチンとして使用した。(5)プラスミドDNAによるマウス免疫は筋肉内接種により行った。3)サルの免疫は大腿部筋肉内への筋肉注、あるいはジーンガンを用いて腹部皮内への投与によって行った。動物実験は各研究施設の動物実験委員会による審査を受け承認されてから行った。
結果と考察
(1)節足動物媒介性ウイルスに対する血清病原体診断法の確立に関する研究。合計7種類のクローンを得た。これらの単クローン性抗体はフラビウイルス属特異的、TBEウイルス群特異的およびTBEウイルス特異的抗体に分類され、蛍光抗体法を用いた同定法に応用することができた。(2)フラビウイルス特異的モノクローナル抗体を用いたデングIgM-ELISA法を従来のデング患者血清由来IgGと比較した従来の測定方法でIgM抗体陰性と診断された血清34例のうち2例が、新IgM-ELISA法でIgM抗体陽性と診断された。これらはいずれもデング様患者より採取されたものであった。改良型IgM-ELISAで陰性と診断された32例の血清検体は、ヒトIgGを用
いたIgM-ELISAではすべて陰性であった。(3)日本脳炎ウイルスにデングウイルスPreMおよびE遺伝子を挿入したキメラウイルスを作製した。このウイルスは蚊培養細胞で高い増殖性を示し、診断用抗原作製に有用であることが示唆された。(2)節足動物媒介性ウイルスの感染状況を病原体およびベクターの両面から把握。1)デング熱媒介蚊であるヒトスジシマカの幼虫に寄生するAscogrenaria sp.は、東北地方、関東地方、関西地方、沖縄地方から採取した幼虫において寄生を認めた。2)NS1に対する抗体測定を行い不顕性感染者の割合を推定した。NS1抗体陽性率が全体で16%であった。日本においてはJEVの暴露を自然界から高率に受けていることが類推された。(3)節足動物媒介性ウイルスに対する新型ワクチンの開発。1)現行日本脳炎ワクチンとアジュバントをマウスに鼻腔内投与することにより血清中和抗体を誘導した。2)リポソームによるDNAワクチンの免疫増強:10ugのDNAワクチンの誘導する中和抗体はDNA単独では検出されなかったが、リポソームと調合して投与した群では1:80以上に上昇した。リポソームがDNAワクチンの免疫誘導能を増強する効果をもつことを示された。3)マウスユビキチン遺伝子が共発現するように設計したベクタープラスミドに、各領域の遺伝子を組み込み作製したプラスミドDNA100ugを3回筋肉内投与して免疫したマウスを実験に用いた。CTLの誘導はNS1、NS2b、NS5免疫マウスに認められた。4)PreM およびE遺伝子、NS3遺伝子、NS5遺伝子のそれぞれを含むデングDNAワクチンをマウスに免疫することにより特異的抗体を誘導した。5)現行日本脳炎ワクチンを接種したカニクイザルにおいては良好な抗体産生が認められた。同様のスケジュールでDNAワクチンをカニクイザルに免疫し、抗体の上昇を測定したところ中和抗体の産生が認められた。6)シンドビスウイルス(SIN)の感染を防御するため、SIN中和能を有するマウス単クローン抗体を抗原として抗イディオタイプ抗体(α-Ids)を作製し、ニワトリ胎児線維芽細胞、BHK細胞およびCOS細胞 へのウイルス吸着およびプラーク形成阻害を検討した。α-Idsクローンのあるものはプラーク形成阻害がみられた。本年度は以下のように研究を実施した。節足動物媒介性ウイルスに対する血清および病原体診断法の確立においてはダニ媒介性脳炎ウイルス北海道株に対して単クローン抗体を作製しダニ媒介性脳炎ウイルス群及び株特異性を解析した。デング熱血清診断用に単クローン抗体を用いたIgM捕捉酵素抗体測定法を確立した。日本脳炎ウイルスとデングウイルスのキメラウイルスを作製し、新しい診断抗原の開発に資した。ベクターの国内における疫学に関しては、デングウイルス媒介蚊であるヒトスジシマカ幼虫への寄生原虫の感染を調査し、寄生原虫の疾病対策への応用への基礎データを得た。日本脳炎非構造蛋白に対する抗体の分布から、日本人の日本脳炎ウイルスに対する暴露に関する基礎データを得た。日本脳炎DNAワクチンの筋肉内投与における免疫原性の増強法、および日本脳炎DNAワクチンにより誘導される防御免疫応答の基礎的データを得た。日本脳炎DNAワクチンがマウスのみでなく、サルにおいても中和抗体を誘導することを確認した。一方、デングDNAワクチンについてもマウスにおける特異的抗体を誘導能を示した。次年度は他の節足動物媒介性ウイルスに対する診断法の確立、ダニを含めベクターサーベイ、新型ワクチンの感染防御能確認等の研究を行う予定である。ヒトスジシマカとAscogrenaria sp.の関係においては、ヒトスジシマカ由来のオーシストに宿主特異性が高い傾向が認められた。今後、生物学的防除法へのAscogrenaria sp.の利用と遺伝子ベクターとして疾病対策に利用する可能性も考慮される。本年度の研究結果により、節足動物媒介性ウイルスの国内における血清診断法の向上が期待される。また、ベクターを含めた疫学結果は日本脳炎の防御、ベクター側からのデング熱の防止対策に活用される。ワクチン開発においては、日本脳炎、デング熱に対する新型ワクチン開発とワクチンの新しい投与法の開発が進んでいる。ワクチン開発
に関する本研究成果は他の節足動物媒介性ウイルスに対するワクチン開発にも応用しうる。
いたIgM-ELISAではすべて陰性であった。(3)日本脳炎ウイルスにデングウイルスPreMおよびE遺伝子を挿入したキメラウイルスを作製した。このウイルスは蚊培養細胞で高い増殖性を示し、診断用抗原作製に有用であることが示唆された。(2)節足動物媒介性ウイルスの感染状況を病原体およびベクターの両面から把握。1)デング熱媒介蚊であるヒトスジシマカの幼虫に寄生するAscogrenaria sp.は、東北地方、関東地方、関西地方、沖縄地方から採取した幼虫において寄生を認めた。2)NS1に対する抗体測定を行い不顕性感染者の割合を推定した。NS1抗体陽性率が全体で16%であった。日本においてはJEVの暴露を自然界から高率に受けていることが類推された。(3)節足動物媒介性ウイルスに対する新型ワクチンの開発。1)現行日本脳炎ワクチンとアジュバントをマウスに鼻腔内投与することにより血清中和抗体を誘導した。2)リポソームによるDNAワクチンの免疫増強:10ugのDNAワクチンの誘導する中和抗体はDNA単独では検出されなかったが、リポソームと調合して投与した群では1:80以上に上昇した。リポソームがDNAワクチンの免疫誘導能を増強する効果をもつことを示された。3)マウスユビキチン遺伝子が共発現するように設計したベクタープラスミドに、各領域の遺伝子を組み込み作製したプラスミドDNA100ugを3回筋肉内投与して免疫したマウスを実験に用いた。CTLの誘導はNS1、NS2b、NS5免疫マウスに認められた。4)PreM およびE遺伝子、NS3遺伝子、NS5遺伝子のそれぞれを含むデングDNAワクチンをマウスに免疫することにより特異的抗体を誘導した。5)現行日本脳炎ワクチンを接種したカニクイザルにおいては良好な抗体産生が認められた。同様のスケジュールでDNAワクチンをカニクイザルに免疫し、抗体の上昇を測定したところ中和抗体の産生が認められた。6)シンドビスウイルス(SIN)の感染を防御するため、SIN中和能を有するマウス単クローン抗体を抗原として抗イディオタイプ抗体(α-Ids)を作製し、ニワトリ胎児線維芽細胞、BHK細胞およびCOS細胞 へのウイルス吸着およびプラーク形成阻害を検討した。α-Idsクローンのあるものはプラーク形成阻害がみられた。本年度は以下のように研究を実施した。節足動物媒介性ウイルスに対する血清および病原体診断法の確立においてはダニ媒介性脳炎ウイルス北海道株に対して単クローン抗体を作製しダニ媒介性脳炎ウイルス群及び株特異性を解析した。デング熱血清診断用に単クローン抗体を用いたIgM捕捉酵素抗体測定法を確立した。日本脳炎ウイルスとデングウイルスのキメラウイルスを作製し、新しい診断抗原の開発に資した。ベクターの国内における疫学に関しては、デングウイルス媒介蚊であるヒトスジシマカ幼虫への寄生原虫の感染を調査し、寄生原虫の疾病対策への応用への基礎データを得た。日本脳炎非構造蛋白に対する抗体の分布から、日本人の日本脳炎ウイルスに対する暴露に関する基礎データを得た。日本脳炎DNAワクチンの筋肉内投与における免疫原性の増強法、および日本脳炎DNAワクチンにより誘導される防御免疫応答の基礎的データを得た。日本脳炎DNAワクチンがマウスのみでなく、サルにおいても中和抗体を誘導することを確認した。一方、デングDNAワクチンについてもマウスにおける特異的抗体を誘導能を示した。次年度は他の節足動物媒介性ウイルスに対する診断法の確立、ダニを含めベクターサーベイ、新型ワクチンの感染防御能確認等の研究を行う予定である。ヒトスジシマカとAscogrenaria sp.の関係においては、ヒトスジシマカ由来のオーシストに宿主特異性が高い傾向が認められた。今後、生物学的防除法へのAscogrenaria sp.の利用と遺伝子ベクターとして疾病対策に利用する可能性も考慮される。本年度の研究結果により、節足動物媒介性ウイルスの国内における血清診断法の向上が期待される。また、ベクターを含めた疫学結果は日本脳炎の防御、ベクター側からのデング熱の防止対策に活用される。ワクチン開発においては、日本脳炎、デング熱に対する新型ワクチン開発とワクチンの新しい投与法の開発が進んでいる。ワクチン開発
に関する本研究成果は他の節足動物媒介性ウイルスに対するワクチン開発にも応用しうる。
結論
節足動物媒介性ウイルスに対する血清病原体診断法として、ダニ媒介性脳炎ウイルス同定法の確立、デングウイルス感染症の血清診断用に単クローン抗体を用いた新型IgM捕捉酵素抗体測定法を確立した。また、日本脳炎、デングキメラウイルスを作製し、診断用抗原作製における有用性を示した。節足動物媒介性ウイルスの疫学については、ヒトスジシマカ幼虫に高率にAscogrenaria sp.が寄生していることと、ヒトが高率に日本脳炎ウイルスに暴露されている可能性が示唆された。節足動物媒介性ウイルスに対する新型ワクチンの開発については、ワクチン鼻腔内投与、新型リポソームによる免疫増強を確認した。日本脳炎DNAワクチンはサルにおける免疫誘導能も確認した。さらに、新たにデングDNAワクチンも作製した。
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