文献情報
文献番号
199900198A
報告書区分
総括
研究課題名
老化関連疾患の病態形成における生体内金属イオン調節機構の役割に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
小川 紀雄(岡山大学医学部分子細胞医学研究施設神経情報学部門)
研究分担者(所属機関)
- 浅沼幹人(岡山大学医学部分子細胞医学研究施設神経情報学部門)
- 岩井一宏(京都大学大学院生命医学研究科認知情報学講座)
- 十川千春(岡山大学歯学部歯科薬理学講座)
- 難波正義(岡山大学医学部分子細胞医学研究施設細胞生物学部門)
- 三野善央(岡山大学医学部衛生学講座)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 長寿科学総合研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
12,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
生体内金属イオン調節機構とその異常機序を明らかにすることによって老化および老化関連疾患の有効な制御法を開発することを目的として、これまで基礎的検討ならびに金属イオン代謝異常の役割に関する検討を行った。本年度は、さらに遺伝子、分子、細胞、臓器レベルでの金属イオンの特異的代謝制御機構と加齢による変化の解析を行った。具体的には、鉄、銅イオンによる水酸化ラジカル (HO・)生成と、脳組織ホモジネートにおける過酸化脂質ならびにcarbonyl化酸化修飾タンパク質(OMP)の経時的変化の検討、鉄代謝制御因子であるIRP2の酸化依存的ユビキチン修飾に関与する酵素群の検索、ヒト正常細胞と不死化細胞に対する鉄の傷害作用の差異と酸素環境条件の影響に関する検討、亜鉛結合タンパク質メタロチオネイン-III (MT-III)、アポトーシス関連蛋白caspase-3とBaxの老齢ラット脳内における発現の変化と酸化ストレスを惹起するlipopolysaccaride (LPS)投与の影響についての検討、培養グリア細胞におけるMT-III遺伝子発現抑制のドパミン(DA)細胞毒性への影響、金属イオンのMT-III mRNA発現に対する影響についての検討、鉄イオンによるHO・生成、脳脂質過酸化および神経細胞死に対するアルミニウム添加の影響、DAとアルミニウムの共存による培養神経細胞生存率の検討、制酸剤および飲料水によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病に関する症例対照研究のメタアナリシス、等を行った。
研究方法
(1) 鉄、銅イオンによるHO・生成、脳ホモジネートの脂質過酸化ならびにタンパク質carbonyl化の経時的変化を、電子スピン共鳴装置によるHO・の検出、ラット前脳ホモジネートの自動酸化による過酸化脂質ならびにOMPの定量により検討した。(2) バキュロウイルス発現系を用いて精製したIRP2を用い、酸化変化を受けたIRP2のin vitro ubiquitination assay系を樹立し、IRP2のユビキチン修飾を指標にIRP2のユビキチン修飾に関与する酵素群の検索を行った。(3) 正常ヒト線維芽細胞ならびにCo60γ線照射で不死化した細胞に、NTAキレート鉄を添加し、細胞増殖率、コロニー形成率、MTTアッセイ、LDH活性の変化を調べた。また、鉄による細胞傷害への1%低酸素環境ならびにフリーラジカル消去剤の影響も検討した。(4) 老齢および若齢ラットを用い、脳、脾臓でのMT-III mRNA発現をRT-PCRにより、脳内でのMT-III, caspase-3, Bax陽性細胞を免疫組織化学染色により検出した。また、LPS投与によるこれらの変化についても検討した。(5) 培養グリア細胞にMT-III mRNAに対するアンチセンスオリゴDNAを導入し、DA添加による細胞生存率の変化を調べた。また、鉄、銅、アルミニウムイオンを添加し、MT-III mRNA発現の変化を検討した。(6) アルミニウムと鉄イオンの共存下でのHO・生成ならびに脳ホモジネートの脂質過酸化を、上述の方法で検討した。また、ラットDA系神経細胞に鉄、銅、亜鉛、アルミニウムイオンを添加し細胞生存率の変化ならびにDA同時添加の影響について検討した。(7) 「アルツハイマー病」、「アルミニウム」、「疫学、コホート研究あるいは症例対照研究」をキーワードとして文献検索し、制酸剤・飲料水によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病についての症例対照研究、ecological研究についてメタアナリシスを行った。
結果と考察
(1) 脳ホモジネートの自動酸化による過酸化脂
質(TBARS量)、carbonyl化酸化修飾タンパク質(OMP量)は、Fe(II), Fe(III)の添加により経時的に著明に亢進し、HO・生成とTBARSならびにOMPの間に強い相関がみられた。鉄イオンはFenton様反応によりHO・を生成し、脂質過酸化、タンパク質酸化、核酸分解などの反応を惹起し、細胞死を招くと考えられていたが、本検討によりはじめて鉄によるHO・生成と脳脂質過酸化ならびにタンパク質carbonyl化の間に強い相関があることを明らかにした。これに対して、Cu(II)添加ではTBARS、OMPの増加はみられず、銅によるHO・生成はセルロプラスミンにより抑制された。銅によるHO・生成と脳脂質過酸化がDA添加により抑制されたという昨年度の結果と併せると、通常の状態では銅イオンの強いHO・生成能はセルロプラスミン、DAなどの生体内高分子によって阻止されて組織傷害性に働きにくくなっていると考えられる。(2) ヒトHeLa細胞のS100ライセートを用い、鉄イオンにより酸化修飾を受けたIRP2が選択的にユビキチン修飾を受けるin vitro ubiquitination assay系を樹立した。ATPのかわりにATPγSを用いても酸化IRP2特異的なユビキチン修飾が観察された。レコンビナントE2(ユビキチン結合酵素)とライセートの陰イオン交換カラム結合分画を用いた検討により、UbcH5a, b, cがIRP2のユビキチン修飾を触媒するE2であることが判明した。これらより、IRP2の酸化修飾そのものが選択的ユビキチン修飾のシグナルとなることが強く示唆された。タンパク質の酸化変化による凝集、封入体形成は種々の神経変性疾患において病因の一つとして注目されており、IRP2の酸化修飾を認識するユビキチン修飾系を検索することは、多くの神経変性疾患における封入体形成メカニズムの解析につながると期待される。 (3) トランスフェリン産生の少ない不死化細胞では鉄添加による細胞死がより強く惹起され、これがミトコンドリア障害によることを明らかにした。不死化細胞は鉄が充分にキレートされないためにフリーラジカルに対して高感受性になっており、これが遺伝子を変異し易くする原因になっていると考えられる。この鉄による細胞傷害はフリーラジカル消去剤で軽減され、また1%低酸素条件下では認められなかったことから、組織の酸素濃度によって左右されると考えられる。(4) 老齢ラットではMT-III mRNAは基底核において若齢ラットに比べ増加し、MT-III陽性細胞は大脳皮質、梨状葉、視床下部、扁桃核で増加していた。MT-IIIはフリーラジカル消去能も有することから、加齢による酸化ストレス増大に対する防御機転と考えられる。若齢ラットではLPS投与によりMT-IIIおよびmRNAの発現は著明に増加したが、老齢ラットではこのLPSによる発現誘導が消失していた。この誘導性の低下が加齢脳の酸化ストレスに対する脆弱性に結びついていると考えられる。さらに、このMT-IIIの加齢に伴う分布ならびに発現動態の変化はcaspase-3のそれと酷似しており、酸化ストレスによるアポトーシス様の脳細胞死にMT-IIIが密接に関与することを示唆するものとして注目される。(5) 培養グリア細胞にMT-IIIアンチセンスオリゴDNAを導入しても細胞生存率は不変であったが、DA添加による細胞生存率の低下はMT-IIIアンチセンスオリゴDNA導入細胞では有意に抑制されていた。これは、DAの細胞障害性に対するMT-IIIの防御的役割を裏付けるものと考えられる。Al(III)添加によりMT-III mRNAの発現はわずかであるが減少したが、Fe(III), Cu(II)添加では不変であった。(6) Al(III)は単独ではHO・生成、脂質過酸化、ラットDA系神経細胞の生存率にほとんど影響を与えなかったが、比較的少量のFe(II)が存在すると、Fe(II)によるHO・生成、脂質過酸化ならびに細胞死を著明に増悪させた。また、生存率に影響しない程度の濃度のDAとAl(III)が共存すると著明な細胞死が惹起された。これらの結果は、アルミニウムが内在性の鉄イオンやDAなどと作用し合って細胞障害性に作用し得ることを示唆している。昨年度報告したアルミニウムによるIRP2のRNA結合能の増加とそれに続く鉄の傷害性の増強を考え併せると、アルミニウムは金属イオンと金属調節タン
パク質の2層にわたり金属による細胞傷害の増悪因子となり得ると考えられる。DA系神経細胞への金属イオン単独添加による神経毒性は、Zn(II)が最も強く、ついでCu(II), Fe(III), Fe(II)の順であった。(7) 制酸剤によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病についての症例対照研究(6件)の併合オッズ比(95%信頼区間)は1.11 (0.85-1.44)であったが、飲料水によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病に関する症例対照研究(3件)のそれは1.17 (1.04-1.31)となり関連が認められた。制酸剤によるアルミニウム摂取はアルツハイマー病の危険要因とはならないが、飲料水によるアルミニウム摂取は危険要因となる可能性が示唆された。
質(TBARS量)、carbonyl化酸化修飾タンパク質(OMP量)は、Fe(II), Fe(III)の添加により経時的に著明に亢進し、HO・生成とTBARSならびにOMPの間に強い相関がみられた。鉄イオンはFenton様反応によりHO・を生成し、脂質過酸化、タンパク質酸化、核酸分解などの反応を惹起し、細胞死を招くと考えられていたが、本検討によりはじめて鉄によるHO・生成と脳脂質過酸化ならびにタンパク質carbonyl化の間に強い相関があることを明らかにした。これに対して、Cu(II)添加ではTBARS、OMPの増加はみられず、銅によるHO・生成はセルロプラスミンにより抑制された。銅によるHO・生成と脳脂質過酸化がDA添加により抑制されたという昨年度の結果と併せると、通常の状態では銅イオンの強いHO・生成能はセルロプラスミン、DAなどの生体内高分子によって阻止されて組織傷害性に働きにくくなっていると考えられる。(2) ヒトHeLa細胞のS100ライセートを用い、鉄イオンにより酸化修飾を受けたIRP2が選択的にユビキチン修飾を受けるin vitro ubiquitination assay系を樹立した。ATPのかわりにATPγSを用いても酸化IRP2特異的なユビキチン修飾が観察された。レコンビナントE2(ユビキチン結合酵素)とライセートの陰イオン交換カラム結合分画を用いた検討により、UbcH5a, b, cがIRP2のユビキチン修飾を触媒するE2であることが判明した。これらより、IRP2の酸化修飾そのものが選択的ユビキチン修飾のシグナルとなることが強く示唆された。タンパク質の酸化変化による凝集、封入体形成は種々の神経変性疾患において病因の一つとして注目されており、IRP2の酸化修飾を認識するユビキチン修飾系を検索することは、多くの神経変性疾患における封入体形成メカニズムの解析につながると期待される。 (3) トランスフェリン産生の少ない不死化細胞では鉄添加による細胞死がより強く惹起され、これがミトコンドリア障害によることを明らかにした。不死化細胞は鉄が充分にキレートされないためにフリーラジカルに対して高感受性になっており、これが遺伝子を変異し易くする原因になっていると考えられる。この鉄による細胞傷害はフリーラジカル消去剤で軽減され、また1%低酸素条件下では認められなかったことから、組織の酸素濃度によって左右されると考えられる。(4) 老齢ラットではMT-III mRNAは基底核において若齢ラットに比べ増加し、MT-III陽性細胞は大脳皮質、梨状葉、視床下部、扁桃核で増加していた。MT-IIIはフリーラジカル消去能も有することから、加齢による酸化ストレス増大に対する防御機転と考えられる。若齢ラットではLPS投与によりMT-IIIおよびmRNAの発現は著明に増加したが、老齢ラットではこのLPSによる発現誘導が消失していた。この誘導性の低下が加齢脳の酸化ストレスに対する脆弱性に結びついていると考えられる。さらに、このMT-IIIの加齢に伴う分布ならびに発現動態の変化はcaspase-3のそれと酷似しており、酸化ストレスによるアポトーシス様の脳細胞死にMT-IIIが密接に関与することを示唆するものとして注目される。(5) 培養グリア細胞にMT-IIIアンチセンスオリゴDNAを導入しても細胞生存率は不変であったが、DA添加による細胞生存率の低下はMT-IIIアンチセンスオリゴDNA導入細胞では有意に抑制されていた。これは、DAの細胞障害性に対するMT-IIIの防御的役割を裏付けるものと考えられる。Al(III)添加によりMT-III mRNAの発現はわずかであるが減少したが、Fe(III), Cu(II)添加では不変であった。(6) Al(III)は単独ではHO・生成、脂質過酸化、ラットDA系神経細胞の生存率にほとんど影響を与えなかったが、比較的少量のFe(II)が存在すると、Fe(II)によるHO・生成、脂質過酸化ならびに細胞死を著明に増悪させた。また、生存率に影響しない程度の濃度のDAとAl(III)が共存すると著明な細胞死が惹起された。これらの結果は、アルミニウムが内在性の鉄イオンやDAなどと作用し合って細胞障害性に作用し得ることを示唆している。昨年度報告したアルミニウムによるIRP2のRNA結合能の増加とそれに続く鉄の傷害性の増強を考え併せると、アルミニウムは金属イオンと金属調節タン
パク質の2層にわたり金属による細胞傷害の増悪因子となり得ると考えられる。DA系神経細胞への金属イオン単独添加による神経毒性は、Zn(II)が最も強く、ついでCu(II), Fe(III), Fe(II)の順であった。(7) 制酸剤によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病についての症例対照研究(6件)の併合オッズ比(95%信頼区間)は1.11 (0.85-1.44)であったが、飲料水によるアルミニウム摂取とアルツハイマー病に関する症例対照研究(3件)のそれは1.17 (1.04-1.31)となり関連が認められた。制酸剤によるアルミニウム摂取はアルツハイマー病の危険要因とはならないが、飲料水によるアルミニウム摂取は危険要因となる可能性が示唆された。
結論
老化関連疾患制御の端緒を拓くことを目的として、遺伝子、分子、細胞、臓器レベルでの金属イオンの特異的代謝制御機構と加齢による変化の解析を行った。アルミニウムと鉄あるいはDAのように、金属イオンの相互連関あるいは生体内高分子によって金属イオンによる細胞傷害性は修飾されていることを明らかにした。トランスフェリン、セルロプラスミン、MT-IIIなどの金属結合タンパク質が酸化ストレスによる細胞傷害に対して防御的に働いていること、また加齢によりMT-IIIの誘導性が低下すること、さらに金属代謝制御因子のIRP2は酸化修飾により選択的ユビキチン修飾をうけることを示した。これらの生体内金属イオン代謝調節機構の異常ならびに破綻が老化関連疾患の病態形成に密接に関与していることを明らかにした。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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