文献情報
文献番号
199900135A
報告書区分
総括
研究課題名
細胞増殖および細胞接着の制御によるがん遺伝子治療法の開発(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
湯尾 明(国立国際医療センター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 高久 史麿(自治医科大学)
- 濱田 洋文(癌研究会癌化学療法センター)
- 今井 浩三(札幌医科大学医学部)
- 平井 久丸(東京大学医学部)
- 官澤 文彦(国立がんセンター研究所)
- 間野 博行(自治医科大学)
- 矢崎 貴仁(慶應義塾大学医学部)
- 石坂 幸人(国立国際医療センター研究所)
- 北村 義浩(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 がん克服戦略研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
離れた部位に位置する細胞間の連絡をつかさどる液性因子(増殖因子、ホルモン、など)や、隣接する細胞間の接着と細胞相互の連絡に携わる因子(接着分子、など)の研究はいずれも現代細胞生物学における重要な研究課題である。その重要性は、がん細胞の増殖や進展においても同様であり、制御機構の解明は直接にがんの治療法にもつながる可能性を有している。近年、細胞の増殖や接着に関わる分子の構造が明らかにされ、その遺伝子が単離されるに及んで、この分野の研究の推進と臨床応用の可能性が広がってきた。本研究においては増殖因子、接着分子などの遺伝子もしくはその遺伝子産物を用いて、がんの増殖や周囲組織への浸潤、遠隔臓器への転移の機構を明らかにするとともに得られた知見を応用してがんのより有効な治療法、すなわちがんの増殖、浸潤、転移の制御による遺伝子治療法を開発することを目的として研究を進める。また、昨年度よりがん細胞を殺す手段として、アポトーシス関連遺伝子を用いる研究も採用され有望な結果を生み出しつつあり、本年度は、その効果的な応用の方策の探究をさらに行う。さらに、本年度はウイルスベクター側の遺伝子工学的な修飾によって、ベクターとして用いるウイルス自体にがん細胞を殺すような作用を持たせるという試みを開始する。
研究方法
細胞は遺伝子導入に使われうるさまざまのヒトおよびマウスの培養細胞株もしくはヒトの正常血球を用いた。樹状細胞の分離、誘導やCTLの誘導は標準的な手法により行った。遺伝子導入は、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスを用いた系や、リポゾームを介した系、膜受容体へのモノクローナル抗体を介したイムノジーン法などを用いた。一部の研究においては、ウイルス自体が抗腫瘍活性を有するベクターの系(アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス)を用いた。遺伝子発現は、細胞系列特異的なプロモーターなどを用いた。増殖は生細胞数の算定、アポトーシスは形態評価やDNA断片化などによってそれぞれ同定した。殺細胞効果は動物実験系においても確認した。遺伝子発現調節系はテトラサイクリン反応性プロモーターを用いて構築した。なお、患者樹状細胞を用いた治療行為が1件有ったが、患者や家族に対する説明と同意、所属施設倫理委員会の審査と了承など、倫理面への配慮を十分に行い、慎重かつ適正に行われた。
結果と考察
Tet-Onシステムによる遺伝子誘導発現系を用いて、ヒト白血病細胞株(HL-60)におけるbcl-2アンチセンス遺伝子の特異な細胞死(自己貪食を伴うプログラムされたネクローシス)誘導作用を明らかにした。Tet-Offシステムによる遺伝子誘導発現系を用いて、Dominant negative IGF-I リセプター遺伝子による大腸癌細胞株の増殖抑制とアポトーシス誘導、抗がん剤感受性増強を確認した。ヒトグリオーマ細胞を用いてアポトーシス関連遺伝子の殺細胞効果を検討し、Caspase-8とNFkB superantagonist、Caspase-9とApaf-1の併用相乗効果を見いだした。 また、ヒトグリオーマ細胞ではBax高発現でグリオーマ細胞がアポトーシスになるかネクローシスになるかはBaxとBcl-XLの発現のバランスにより決まること、Bcl-2とBcl-XLでは、Bcl-XLの方がよりアポトーシス抑制作用が強力であることを確認した。さらに、ヒトグリオーマ細胞においては、Myelin basic protein プロモ
ーターなどの組織特異的(神経系特異的)プロモーターの使用によって、腫瘍特異的なアポトーシス誘導が可能であった。慢性骨髄性白血病(CML)患者末梢血より得られた患者樹状細胞に b3a2型 bcr/ablペプチドをパルスしてCTLの誘導を試みたところ、このペプチドに特異的に反応するCD8陽性T細胞を樹立することができた。HLA型においては、A*0201およびA*2402を持つ患者で樹立できた。このCTLは、HLAを発現していないかHLA型が異なるCML細胞株や、HLAが異なるCML患者の腫瘍細胞に対しては反応せず、同じHLAを発現する自己の樹状細胞や骨髄細胞や人工的に同じHLAを発現させたCML細胞株のみに対して特異的に細胞障害活性を発揮した。また、患者血球の中でも腫瘍由来クローンではないと考えられる自己T細胞に対しては細胞障害活性を示さなかった。2例のCML患者に対して、末梢血単核球由来樹状細胞使用BCR/ABLペプチド免疫療法を行い、問題となる短期的な副作用を認めず、1例においてBCR/ABLペプチドDTHテスト陽性、BCR/ABL陽性白血病細胞の減少が確認された。E1欠損アデノウイルス(AxE1AdB)のTPC付加体リポ化DNAのマウス静脈内投与により、AxE1AdB遺伝子の腫瘍への分布と腫瘍細胞の増殖抑制を得た。この増殖抑制効果は、E1欠損アデノウイルス(AxE1AdB)のTPC付加体リポ化DNAを投与後10日後まで持続し、その後腫瘍は再増殖した。また、治療開始時期の腫瘍径が小さい方が効果的な腫瘍の縮小が得られた。改良型選択的増幅遺伝子を用いることで生体内ホルモンや生体内造血因子の影響を受けずに人為的に造血幹細胞の増殖制御が可能なことがマウスの系において証明された。すなわち、細胞外領域の一部を欠失してG-CSFには反応しないG-CSF受容体とタモキシフェン特異的に反応するエストロジェン受容体の融合受容体をレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入系により血液細胞に導入、発現させて、タモキシフェン特異的な細胞増殖などを確認した。膀胱癌細胞株を用いた in vitro 解析では、用いたいずれの膀胱がん細胞株においても、条件複製型ヘルペスウイルスG207は著明な殺細胞効果を示し、両細胞共に感染後7日後までにすべての細胞が死滅した。これらの膀胱癌を用いた in vivo 解析では、皮下移植モデルに対する腫瘍内投与で有効であることはもちろんのこと、静注による血管内投与でも著明な腫瘍抑制効果が認められた。また、膀胱内腫瘍モデルを用いた膀胱内投与も効果を発揮した。なお、他臓器への副作用は認められなかった。レセプター型チロシンキナーゼRET細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体やRET細胞外ドメインに結合する新規ペプチドを用いて神経芽腫細胞及び造血幹細胞に外来遺伝子を導入し発現させた。その他に、胆道がん細胞、大腸がん細胞に対するモノクローナル抗体が得られた。INI1(SNF5)発現するレトロウイルス(MLV)ベクターを作製し、INI1-negativeの malignant rhabdoid tumor 由来細胞株にINI1を発現させたところgrowth arrest を起こした。以上の研究成果により、さまざまの種類のがん細胞において、特定の遺伝子導入や特定の変異型ウイルスが腫瘍細胞のアポトーシス、ネクローシス(autophagy)、増殖抑制、抗がん剤感受性上昇などを誘導することなどが明らかにされ、がんの遺伝子治療法の新しいモデルがいくつか示された。また、今年度はいくつかの系において経静脈全身投与による遺伝子治療の可能性が示され、進行癌の治療への応用が有望であった。今後は、これらの実験系が臨床応用につながるような具体的な研究の推進が重要であると考えられた。また、得られた結果の中には全く新しい知見もあり、その機序の解析などの基礎検討も併せて進める必要があると考えられる。
ーターなどの組織特異的(神経系特異的)プロモーターの使用によって、腫瘍特異的なアポトーシス誘導が可能であった。慢性骨髄性白血病(CML)患者末梢血より得られた患者樹状細胞に b3a2型 bcr/ablペプチドをパルスしてCTLの誘導を試みたところ、このペプチドに特異的に反応するCD8陽性T細胞を樹立することができた。HLA型においては、A*0201およびA*2402を持つ患者で樹立できた。このCTLは、HLAを発現していないかHLA型が異なるCML細胞株や、HLAが異なるCML患者の腫瘍細胞に対しては反応せず、同じHLAを発現する自己の樹状細胞や骨髄細胞や人工的に同じHLAを発現させたCML細胞株のみに対して特異的に細胞障害活性を発揮した。また、患者血球の中でも腫瘍由来クローンではないと考えられる自己T細胞に対しては細胞障害活性を示さなかった。2例のCML患者に対して、末梢血単核球由来樹状細胞使用BCR/ABLペプチド免疫療法を行い、問題となる短期的な副作用を認めず、1例においてBCR/ABLペプチドDTHテスト陽性、BCR/ABL陽性白血病細胞の減少が確認された。E1欠損アデノウイルス(AxE1AdB)のTPC付加体リポ化DNAのマウス静脈内投与により、AxE1AdB遺伝子の腫瘍への分布と腫瘍細胞の増殖抑制を得た。この増殖抑制効果は、E1欠損アデノウイルス(AxE1AdB)のTPC付加体リポ化DNAを投与後10日後まで持続し、その後腫瘍は再増殖した。また、治療開始時期の腫瘍径が小さい方が効果的な腫瘍の縮小が得られた。改良型選択的増幅遺伝子を用いることで生体内ホルモンや生体内造血因子の影響を受けずに人為的に造血幹細胞の増殖制御が可能なことがマウスの系において証明された。すなわち、細胞外領域の一部を欠失してG-CSFには反応しないG-CSF受容体とタモキシフェン特異的に反応するエストロジェン受容体の融合受容体をレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入系により血液細胞に導入、発現させて、タモキシフェン特異的な細胞増殖などを確認した。膀胱癌細胞株を用いた in vitro 解析では、用いたいずれの膀胱がん細胞株においても、条件複製型ヘルペスウイルスG207は著明な殺細胞効果を示し、両細胞共に感染後7日後までにすべての細胞が死滅した。これらの膀胱癌を用いた in vivo 解析では、皮下移植モデルに対する腫瘍内投与で有効であることはもちろんのこと、静注による血管内投与でも著明な腫瘍抑制効果が認められた。また、膀胱内腫瘍モデルを用いた膀胱内投与も効果を発揮した。なお、他臓器への副作用は認められなかった。レセプター型チロシンキナーゼRET細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体やRET細胞外ドメインに結合する新規ペプチドを用いて神経芽腫細胞及び造血幹細胞に外来遺伝子を導入し発現させた。その他に、胆道がん細胞、大腸がん細胞に対するモノクローナル抗体が得られた。INI1(SNF5)発現するレトロウイルス(MLV)ベクターを作製し、INI1-negativeの malignant rhabdoid tumor 由来細胞株にINI1を発現させたところgrowth arrest を起こした。以上の研究成果により、さまざまの種類のがん細胞において、特定の遺伝子導入や特定の変異型ウイルスが腫瘍細胞のアポトーシス、ネクローシス(autophagy)、増殖抑制、抗がん剤感受性上昇などを誘導することなどが明らかにされ、がんの遺伝子治療法の新しいモデルがいくつか示された。また、今年度はいくつかの系において経静脈全身投与による遺伝子治療の可能性が示され、進行癌の治療への応用が有望であった。今後は、これらの実験系が臨床応用につながるような具体的な研究の推進が重要であると考えられた。また、得られた結果の中には全く新しい知見もあり、その機序の解析などの基礎検討も併せて進める必要があると考えられる。
結論
本研究により、Caspase 8、Caspase 9、Apaf-1 などによるアポトーシス誘導、Bcl-2アンチセンスやIGF受容体dominant negativeによるネクローシスや増殖抑制、改変型アデノウイルスや改変型単純ヘルペスウイルスなどの変異ウイルス自体の殺細胞効果、が明らかにされ、新たな遺伝子治療の可能性が示された。また、樹状細胞を用いた難治性白血病の新しい免疫遺伝子治療
法、ベクター機能を有するモノクローナル抗体を用いた腫瘍特異的な遺伝子デリバリーシステム、臓器特異的な遺伝子発現システム、なども開発された。
法、ベクター機能を有するモノクローナル抗体を用いた腫瘍特異的な遺伝子デリバリーシステム、臓器特異的な遺伝子発現システム、なども開発された。
公開日・更新日
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