網羅的エピゲノム解析を用いた化学物質による次世代影響の解明：新しい試験スキームへの基礎的検討

文献情報

• 文献番号: 201926002A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 網羅的エピゲノム解析を用いた化学物質による次世代影響の解明：新しい試験スキームへの基礎的検討
• 課題番号: H29-化学-一般-002
• 研究年度: 令和1(2019)年度
• 研究代表者(所属機関): 岸 玲子(北海道大学 環境健康科学研究教育センター)

研究分担者(所属機関)

• 堀　就英(福岡県保健環境研究所　保健科学部　生活化学課)
• 三宅　邦夫(山梨大学　大学院総合研究部)
• 松村　徹(いであ株式会社)
• 石塚　真由美(北海道大学　大学院獣医学研究院)
• 佐田　文宏(中央大学　保健センター)
• 荒木　敦子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 宮下　ちひろ(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 伊藤　佐智子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 山崎　圭子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 三浦　りゅう(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 松浦　英幸(北海道大学　大学院農学研究院)
• 篠原　信雄(北海道大学　大学院医学研究院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成29(2017)年度
• 研究終了予定年度: 令和1(2019)年度
• 研究費: 17,349,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

種々の環境化学物質曝露による次世代の多様な疾病エンドポイントへの影響を解明するために,網羅的エピゲノム解析により化学物質がエピゲノム変化を介して影響する新規の毒性メカニズムを遺伝的差異や多様なライフスタイルをもつヒト集団で明らかにする。具体的には, ①曝露により変化するDNAメチル化領域を45万か所のメチル化部位（CpG部位）の網羅的解析により同定し，どのような機能を持つ遺伝子・経路が影響を受けるかを明らかにする。②それぞれの曝露に起因するメチル化変化がどのアウトカムに関与するのか，影響の何％（介在の大きさ）をメチル化変化で説明できるのかを介在解析（Mediation analysis）により明確にする。③網羅的解析結果の妥当性を検証するため，次世代シークエンサーによる多サンプルメチル化定量法を確立する。また，海外のコホートとの共同研究により検証（validation）の効率化を図る。④遺伝子多型（SNPs）の影響を検討し, 遺伝的差異を背景にもつヒト集団でのメチル化変化を明らかにする。以上の検討により，胎児期の環境化学物質曝露と成長後の疾病発現をつなぐ分子メカニズムとして, エピゲノム試験法開発に資する。

研究方法

(１) EUのバイオモニタリンググループであるHuman Biomonitoring for EU (HB4EU)では，1つの構造異性体のみの曝露評価ではなく，複数の構造異性体を含めたDiNP代謝物の定量法を用いている。北海道スタディでも同様の評価をするため，胎児期曝露評価として妊娠初期血清1786検体を用いて代謝物であるフタル酸モノエステル類（cx-MiNP）の再分析を実施した。(２)フタル酸エステル類の胎児期曝露について，臍帯血DNAメチル化のエピゲノム網羅的解析を行った。(３)臍帯血試料を対象にダイオキシン類・PCBsの異性体定量分析を実施した。(４)エピゲノム網羅的DNAメチル化変化と胎児期ダイオキシン類曝露との関連を検討した。(５)次世代シークエンサーを用いた領域特異的メチル化解析とADHDの関連を検討するため，ADHDケース・サブコホート1263名を対象とした。

結果と考察

(１)ヒト血清および尿検体を対象に，異性体を含むcx-MiNP， MiNP，OH-MiNPについて再定量した結果，全ての代謝物について検出率および中央値濃度が増加し，健康影響との関連について統計解析に用いることが可能となった。(２)フタル酸エステル類の曝露により代謝系に関わる遺伝子のメチル化が影響を受けていること，それらのメチル化変化は出生時のポンデラル指数の低下と関連することを明らかにした。さらに，媒介分析により，胎児期曝露による出生児のポンデラル指数低下への影響にそれらのメチル化変化が関与している可能性を示唆した。(３)ダイオキシン類・PCBsの平均値及び濃度範囲を過去の報告事例と比較したところ，脂肪重量当たりのダイオキシン類濃度は同等となり，PCBs濃度はやや低い傾向が認められた。85名の妊産婦から採取された臍帯血試料は，本研究事業の主たる目的である一般的なヒトの集団におけるダイオキシン類・PCBsの次世代影響評価に適切な試料であると考えられた。(４)ダイオキシン類濃度と関連があったCpG（遺伝子）は男児のcg01228410（SLC9A3, FDR= 0.041）のみで，女児では同定されなかった。男児で高メチル化の割合が高く，DNA高メチル化変化量（logFC）は大きかった。本研究から，ダイオキシン類の胎児期曝露によるエピゲノム変化は性差がある可能性が示唆された。 (５)妊娠後期のコチニン濃度で非喫煙・受動喫煙・能動喫煙の3群で分類し場合，非喫煙と比較し能動喫煙で6歳のADHD傾向のオッズ比が有意に増加した(OR = 2.51; 95% CI [1.32, 4.75]）。妊婦（能動）の喫煙とADHD傾向の関連においてAHRRのメチル化の媒介(mediation)分析した結果，AHRRの2つのCpGで間接効果が認められた。

結論

一般環境レベルのDEHPおよびダイオキシン類曝露でも，臍帯血DNAメチル化を変化させ，出生児のポンデラル指数低下への影響に関与する可能性が示唆された。さらに，次世代シークエンサーを用いた特異的遺伝子領域のDNAメチル化解析により，妊婦の喫煙と６歳児のADHD傾向の関連についてAHRRの2つのCpGのメチル化が媒介することを明らかにした。将来的に，化学物質曝露に誘引されるDNAメチル化変化がどのアウトカムに影響するかを介在の大きさを含めて明らかにし, 胎児期の化学物質曝露と成長後の疾病発現をつなぐ分子メカニズムとして, エピゲノム試験法開発につなげる。

公開日・更新日

• 公開日: 2020-12-14
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201926002B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 網羅的エピゲノム解析を用いた化学物質による次世代影響の解明：新しい試験スキームへの基礎的検討
• 課題番号: H29-化学-一般-002
• 研究年度: 令和1(2019)年度
• 研究代表者(所属機関): 岸 玲子(北海道大学 環境健康科学研究教育センター)

研究分担者(所属機関)

• 三宅　邦夫(山梨大学　大学院総合研究部)
• 石塚　真由美(北海道大学　大学院獣医学研究)
• 佐田　文宏(中央大学　保健センター)
• 荒木　敦子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 宮下　ちひろ(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 伊藤　佐智子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 山崎　圭子(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 三浦　りゅう(北海道大学　環境健康科学研究教育センター)
• 堀　就英(福岡県保健環境研究所　保健科学部　生活化学課)
• 松村　徹(いであ株式会社)
• 松浦　英幸(北海道大学　大学院農学研究院)
• 篠原　信雄(北海道大学　大学院医学研究院)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 化学物質リスク研究
• 研究開始年度: 平成29(2017)年度
• 研究終了予定年度: 令和1(2019)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

種々の環境化学物質曝露による次世代の多様な疾病エンドポイントへの影響を解明するために，化学物質がエピゲノム変化を介して影響する新規の毒性メカニズムを遺伝的差異や多様なライフスタイルをもつヒト集団で明らかにする。具体的には, ①曝露により変化するDNAメチル化領域を45万か所のメチル化部位（CpG部位）の網羅的解析により同定し，どのような機能を持つ遺伝子・経路が影響を受けるかを明らかにする。②それぞれの曝露に起因するメチル化変化がどのアウトカムに関与するのか，影響の何％をメチル化変化で説明できるのかを介在解析（Mediation analysis）により明確にする。③網羅的解析結果の妥当性を検証するため，次世代シークエンサーによる多サンプルメチル化定量法を確立する。また，海外のコホートとの共同研究により検証（validation）の効率化を図る。④遺伝子多型（SNPs）の影響を検討し, 遺伝的差異を背景にもつヒト集団でのメチル化変化を明らかにする。以上の検討により，胎児期の環境化学物質曝露と成長後の疾病発現をつなぐ分子メカニズムとして, エピゲノム試験法開発に資する。

研究方法

(1)妊娠初期血清中フタル酸モノエステル類7種（MnBP，MiBP，MBzP，MEHP，MEHHP，MECPP，cx-MiNP)，および臍帯血中のダイオキシン類・PCBsの異性体定量分析を実施した。(2)胎児発育関連遺伝子IGF2/H19，LINE1領域の臍帯血DNAメチル化率をパイロシークエンサーにより測定し，ダイオキシン・PCB類の胎児期曝露との関連を検討した。(3)臍帯血DNAのエピゲノム網羅的メチル化解析（45万か所メチル化部位）と母体血中の化学物質との関連を解析し，曝露により変化するDNAメチル化部位を同定した。(4)喫煙経験のない非喫煙群, 妊娠中喫煙群, 妊娠中の喫煙中止群の3群を解析対象とし，胎児期の喫煙曝露により変化する臍帯血DNAのメチル化部位をエピゲノム網羅的解析により同定した。(5)次世代シークエンサーを用いて領域特異的メチル化解析とADHDの関連を検討するため，ADHDケース・サブコホート1263名を対象とした。

結果と考察

(1)フタル酸エステル類のDnBP，DiBPの一次代謝物であるMnBP，MiBPの妊娠初期血清中濃度が諸外国より高レベルであった。臍帯血中のダイオキシン類・PCBsが定量された。
(2)PCB異性体とH19およびLINE-1のDNAメチル化率と正の相関が認められ, その傾向は女児で顕著だった。(3) 網羅的エピゲノム解析との関連で，PFOSとPFOA曝露のメチル化への影響の差異が示唆された。BPA曝露でメチル化変化の増減の割合と遺伝子のネットワーク形成や機能にも男女で差異がみられ，メチル化への作用機序に性差による違いが示唆された。ダイオキシン類曝露で男児での高メチル化の割合が高くメチル化変化量も大きく，性差がある可能性が示唆された。フタル酸エステル類の曝露が代謝系に関わる遺伝子のメチル化を変化させ，胎児期曝露による出生児のポンデラル指数低下への影響にそれらのメチル化変化が関与している可能性を媒介分析により示した。(4)妊娠中に喫煙を中止するとDNAメチル化状態が非喫煙者と同等レベルになる9か所のCpGs，喫煙を中止しても変化しない1つのCpGを見出した。(5)妊娠後期のコチニン濃度で非喫煙・受動喫煙・能動喫煙の3群で分類した場合，非喫煙と比較し能動喫煙で6歳のADHD傾向のオッズ比が有意に増加した(OR = 2.51; 95% CI [1.32, 4.75]）。妊婦（能動）の喫煙とADHD傾向の関連においてAHRRのメチル化の媒介(mediation)分析した結果，AHRRの2つのCpGで間接効果が認められた。

結論

パイロシークエンスおよびエピゲノム網羅的メチル化解析において，一般環境レベルのPFOA・PFOS・BPA・ダイオキシン類・PCBの曝露はDNAメチル化変化に関連し，メチル化への作用機序に性差による違いが示唆された。DEHP曝露で，臍帯血DNAメチル化を変化させ，出生児のポンデラル指数低下への影響に関与する可能性が示唆された。次世代シークエンサーを用いた特異的遺伝子領域のDNAメチル化解析により，妊婦の喫煙と６歳児のADHD傾向の関連についてAHRRの2つのCpGのメチル化が媒介することを明らかにした。将来的に，化学物質曝露に誘引されるDNAメチル化変化がどのアウトカムに影響するかを介在の大きさを含めて明らかにし, 胎児期の化学物質曝露と成長後の疾病発現をつなぐ分子メカニズムとして, エピゲノム試験法開発につなげる。

公開日・更新日

• 公開日: 2020-12-14
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201926002C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 胎児期の化学物質（フタル酸エステル類（DEHP）、ビスフェノールA （BPA）、有機フッ素化合物、PCBダイオキシン類、喫煙）曝露によって変化するDNAメチル化領域を45万か所 CpG 部位の網羅的解析により同定した。さらに，胎児期の喫煙曝露により変化するDNAメチル化領域を同定し，次世代シークエンサーにより定量的なメチル化検証を行った。母親が妊娠中の喫煙を中止することにより臍帯血中DNAメチル化状態が非喫煙者と同等レベルになる9CpGs，喫煙を中止しても変化しない1CpGを見出すことができた。
• 臨床的観点からの成果: 胎児期DEHP曝露による出生児のポンデラル指数低下への影響に臍帯血中DNAメチル化変化が関与する可能性を示した。妊婦の喫煙と6歳児のADHDの関連においてAHRRの2CpGsが媒介することを明らかにした。次世代シークエンサーによる多サンプルの定量的メチル化解析法の確立は，今後，エピゲノム解析を進めるための有効な試験法開発研究となる。ヒトを対象に，胎児期の化学物質曝露によるメチル化変化が将来の発達障害，代謝異常などの疾病アウトカムにどう関係するかを解析して，疾病予防に実際に結びつくかを解明する。
• ガイドライン等の開発: WHOでは環境化学物質の次世代影響に注目し，UNEP(国連環境プログラム)とも連携し，報告書を作成している。近年は特に人を対象に各国で疫学研究のデータが蓄積されてきており，環境化学物質規制に関するガイドライン作成や基準値策定のための科学的根拠を国際的に重要視してきている。本研究では化学物質曝露による次世代影響を明らかにしてきたが，WHO等との国際協力を進めながら，国際的なガイドライン作成や基準値策定のための科学的根拠として今後，日本発の最新のデータを提供できる。
• その他行政的観点からの成果: 行政が化学物質曝露による次世代影響を検討する上で，現在も使用されている有機フッ素化合物、ビスフェノールA、およびフタル酸エステル類に関する低濃度曝露での影響評価は安全基準への有用なデータとなる。メチル化変化を誘引しやすい化学物質や影響を及ぼす生体メカニズムが明らかとなり，信頼性の高い化学物質のリスク評価法につなげることができる。今後，動物実験や in vitro 試験法，技術開発，政策上優先的に検討すべき重要なアウトカムを示すことができる。
• その他のインパクト: POPs条約により規制されている化学物質のみならず，近年，増加している有機フッ素化合物や短半減期物質のフタル酸エステル類，ビスフェノールAを対象としているので，対策の必要性を検討する際の科学的な基礎資料となる。本研究を実施する北海道大学環境健康科学研究教育センターは，これまでの研究成果により2015年からWHO研究協力センター（環境化学物質による健康障害の予防）に正式認証された。2019年には再認証を受け、引き続きグローバルな連携・協力政策に日本発のエビデンスとして貢献できる。

発表件数

• 原著論文（和文）: 8件
• 原著論文（英文等）: 42件
• その他論文(和文): 6件 ; 書籍「DOHaD先制医療への展開」（第6章）を含む
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 23件
• 学会発表(国際学会等): 14件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 1件 ; 講演会1件（北海道スタディ函館講演会）

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yamazaki K., Itoh S., Ikeda-Araki A., et al; Association of prenatal exposure to dioxin-like compounds, polychlorinated biphenyl, and methylmercury with event-related brain potentials in school-aged children: The Hokkaido study; Neurotoxicology , 91 , 11-21 (2022)
• 原著論文2: Lozano M., Yousefi P., Broberg K. et al; DNA methylation changes associated with prenatal mercury exposure: A meta-analysis of prospective cohort studies from PACE consortium; Environmental Research , 24 Part B (112093) (2022)
• 原著論文3: Kobayashi S., Sata F., Miyashita C. et al; Associations between maternal mono-(2-ethylhexyl) phthalate levels, nuclear receptor gene polymorphisms, and fatty acid levels in pregnant Japanese women in the Hokkaido study; Reproductive Toxicology , 107 , 22-32 (2022)
• 原著論文4: Kobayashi S., Sata F., Ikeda-Araki A. et al; Relationships between maternal perfluoroalkyl substance levels, polymorphisms of receptor genes, and adverse birth outcomes in the Hokkaido birth cohort study, Japan; Reproductive Toxicology , 107 , 112-122 (2022)
• 原著論文5: Miura R. , Araki A., Ishihara T., et al; Effect of prenatal exposure to phthalates on epigenome-wide DNA methylations in cord blood and implications for fetal growth: The Hokkaido Study on Environment and Children’s Health; Science of the Total Environment , 783 (2021); https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.147035
• 原著論文6: Miyashita C., Araki A., Miura R., et al; Prevalence of childhood wheeze and modified DNA methylation at 7 years of age according to maternal folate levels during pregnancy in the Hokkaido Study; Pediatric Allergy and Immunology , 32 , 514-523 (2021); 10.1111/pai.13425
• 原著論文7: Miyake K., Miyashita C. (co-first author), Araki A., et al; DNA methylation of GFI1 as a mediator of the association between prenatal smoking exposure and ADHD symptoms at 6 years: the Hokkaido Study on Environment and Children’s Health; Clinical Epigenetics , 13(1) (74) (2021); 10.1186/s13148-021-01063-z
• 原著論文8: Kishi R., Ikeda-Araki A., Miyashita C., et al; The Hokkaido Birth Cohort Study on Environment and Children’s Health: cohort profile 2021; Environmental Health and Preventive Medicine , 26 (2021); 10.1016/j.envint.2019.105139
• 原著論文9: Kobayashi S., Sata F., Ikeda-Araki A. et al; Associations among maternal perfluoroalkyl substance levels, fetal sex-hormone enzymatic gene polymorphisms, and fetal sex hormone levels in the Hokkaido study; Reprod Toxicol , 105 , 221-231 (2021); 10.1016/j.reprotox.2021.09.003
• 原著論文10: Yim G., Minatoya M., Kioumourtzoglou M. A. et al; The associations of prenatal exposure to dioxins and polychlorinated biphenyls with neurodevelopment at 6 Months of age: Multi-pollutant approaches; Environ Res , 112757 (2021); 10.1016/j.envres.2022.112757
• 原著論文11: Kobayashi S., Sata F., Goudarzi H. et al; Associations among perfluorooctanesulfonic/perfluorooctanoic acid levels, nuclear receptor gene polymorphisms, and lipid levels in pregnant women in the Hokkaido study; Scientific Reports , 11 , 9994- (2021)
• 原著論文12: Tamura N., Hanaoka T., Ito K. et al; Mediating Factors between Parental Socioeconomic Status and Small for Gestational Age in Infants: Results from the Hokkaido Study on Environment and Children’s Health; Maternal and Child Health Journal , 25 , 645-655 (2021); doi.org/10.1007/s10995-020-03035-w
• 原著論文13: Kashino I., Sasaki S., Okada E.,et al.; Prenatal exposure to 11 perfluoroalkyl substances and fetal growth: A large-scale, prostective birth cohort study; Environment International , 136 , 105355- (2020); 10.1016/j.envint.2019.105355
• 原著論文14: Yamazaki K., Itoh S., Araki A. et al; Associations between prenatal exposure to organochlorine pesticides and thyroid hormone levels in mothers and infants: The Hokkaido study on environment and children's health; Environ Res , 189 (2020)
• 原著論文15: Miura R., Araki A., Minatoya M., et al.; An epigenome-wide analysis of cord blood DNA methylation reveals sex-specific effect of exposure to bisphenol A; Scientific Report , 9 (1) , 12369- (2019); 10.1038/s41598-019-48916-5
• 原著論文16: Miyashita C., Araki A., Mitsui T., et al.; Sex-related differences in the associations between maternal dioxin-like compounds and reproductive and steroid hormones in cord blood: the Hokkaido Study; Environment International , 117 , 175-185 (2018); 10.1016/j.envint.2018.04.046
• 原著論文17: Miura R., Araki A., Miyashita C., et al.; An epigenome-wide study of cord blood DNA methylations in relation to prenatal perfluoroalkyl substance exposure: the Hokkaido study; Environment International , 115 , 21-28 (2018); 10.1016/j.envint.2018.03.004
• 原著論文18: Miyake K., Kawaguchi A., Miura R., et al.; Association of DNA methylation in cord blood and maternal smoking exposure: The Hokkaido Study on Environment and Children’s Health; Scientific Report , 8 , 5654- (2018); 10.1038/s41598-018-23772-x
• 原著論文19: Ikeno T., Miyashita C., Nakajima S. et al; Effects of low-level prenatal exposure to dioxins on cognitive development in Japanese children at 42months; Sci Total Environ , 618 , 1423-1430 (2018)
• 原著論文20: Miyashita C., Ait Bamai Y., Araki A. et al; Prenatal exposure to dioxin-like compounds is associated with decreased cord blood IgE and increased risk of wheezing in children aged up to 7 years: The Hokkaido Study; Science of the Total Environment , 610-611 (2018)

公開日・更新日

• 公開日: 2022-07-13
• 更新日: 2023-07-28

収支報告書

• 文献番号: 201926002Z
• 報告年月日: 2020年09月24日

収入

• (1)補助金交付額: 21,300,000円
• (2)補助金確定額: 21,300,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	11,135,773円
		人件費・謝金	2,195,656円
		旅費	1,111,673円
		その他	2,905,908円
	間接経費		3,951,000円
	合計		21,300,010円

備考

備考

収入の「(2)補助金確定額」と、支出の「合計」の差額10円は預金利息

公開日・更新日

• 公開日: 2020-11-25
• 更新日: -