文献情報
文献番号
199800493A
報告書区分
総括
研究課題名
デングウイルス及び日本脳炎ウイルスに対する新型ワクチンの開発に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
倉根 一郎(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 小西英二(神戸大学医学部)
- 山岡政興(兵庫県立衛生研究所)
- 山田章雄(国立感染症研究所)
- 中山幹男(国立感染症研究所)
- 山田堅一郎(国立感染症研究所)
- 高崎智彦(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
22,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
当研究は再興感染症として世界的に大きな問題となっており、日本においても問題になりつつあるウイルス感染症であるデング熱・デング出血熱と日本脳炎の防御対策を主題としたものである。当研究の目的はデングウイルスや日本脳炎ウイルスに対する新しいタイプのワクチンの開発であり具体的には以下の目的を持つ。(1)デングウイルスや日本脳炎ウイルスに対する防御免疫の解明、(2)遺伝子組み換えによるワクチン、特にDNA ワクチンの開発、(3)日本脳炎ウイルスワクチンやデングワクチンのデング出血熱病態形成への影響の解明。デングウイルスに対するワクチンは現在実用化されたものがなくワクチン開発は日本のみならず世界的に強く望まれている。また日本脳炎ワクチンに関しては、現在用いられている感染マウス脳由来不活化ワクチンに代わる、安価でより安全なワクチンが望まれている。当研究により、デングウイルスや日本脳炎ウイルスに対して高い防御免疫誘導能を持ち、副作用がなく安全で安価なワクチンの開発を可能にする。
研究方法
(1)日本脳炎ウイルス遺伝子を含むプラスミドの構築と免疫原性の検討:新たに3種のプラスミドを作製した。シグナル及びprM(塩基番号325-882)を含むプラスミド(pcJEprM)、Eの前半(塩基番号883-1599)を含むプラスミド(pcJEprM)及びEの後半(塩基番号1600-2382)を含むプラスミド(pcJEprM)である。PBSで希釈したDNA溶液の100ulを筋肉内に1回または2週間隔で2回接種することによりマウスを免疫した。(2)デング2型ウイルス遺伝子を含むプラスミドの構築と免疫原性の検討:免疫原としてマウスあたり100ugあるいは10ugのpcJE ME、100ugのpcJEprM、 pcJEE1/2あるいは pcJEE2/2を用いた。最終の免疫後、2-4週目に10,000LD50の北京P3株を腹腔内に接種することにより攻撃した。デング2型ウイルスNGC株からクローン化したcDNAを鋳型にしてpcD2MEを作製した。デングウイルス2型NS3蛋白を発現するプラスミドも同様に構築した。 (3)ブタ免疫実験:8-12週令の去勢雄または雌のミニブタ(ヨークシャー種)を用いた。ブタに1頭あたり400ug(筋肉内)または2.6ug(ジーンガン)のpcJEMEを5週間隔(筋肉内)または4週間隔(ジーンガン)で2回接種した。ジーンガンによる接種は、DNAを吸着させた金粒子を6ショット、ブタ腹部の皮膚に投与することにより行った。攻撃実験においては450ugのpNJEMEを筋肉内に3週間隔で2回接種後14週目のブタ5頭、及び1mlの不活化ワクチンを皮下に2週間隔で2回接種後15週目のブタ5頭を攻撃実験に用いた。 (4)日本脳炎ウイルスによるサルの感染:5頭のカニクイザルに日本脳炎ウイルスを0.5mlずつ経鼻接種し2-3日おきに体温測定を行うと同時に臨床経過を観察した。観察期間中に瀕死となった個体は麻酔下で安楽殺した。観察期間内に死亡したものも含めて病理学的に検索した。
結果と考察
(1) pcJEME免疫マウスはすべてが攻撃前に1:10から1:20の中和抗体価を有しており、攻撃後4日目に1:160から1:320、8日目に1:320から1:1280に上昇し、すべてのマウスが生残した。4週令のICRマウスを100ugあるいは10ugのpcJEMEまたはPBSを1回筋肉内接種した後、4週目に10,000LD50の北京P3株により攻撃した。生残したのは100ugのpcJEME免疫群の4匹のみであった。攻撃前に中和抗体が検出されたICRマウスは100ug免疫群5匹中1匹のみであった。攻撃後には100ug接種群のマウス3匹に中和抗体の上昇がみられ、4日目に1:80以上の抗体価を示し、21日間生残した。またIgMクラスの抗prM/E
抗体は大部分のマウスにおいて攻撃後4日目に最大値となった。ほとんどすべてのマウスにおいて抗NS1抗体価は観察期間中上昇し、特に数匹のマウスにおいては死の直前に急激な上昇が認められた。(2)pcD2MEをBALB/cマウスに2週間隔で2回から3回筋肉内接種した。100ugのpcD2MEにより2回免疫したマウスには、抗体価が1:10の中和抗体が誘導された。一方、1ugあるいは10ugのpcD2MEを2回免疫したマウスには、検出できる中和抗体は誘導されなかった。免疫マウスをNGC株により腹腔内接種した後の、中和抗体の推移を調べた。100ugのpcD2MEにより3回免疫した5匹のマウスの内1匹に1:10の中和抗体価が攻撃前に認められた。攻撃後、すべての免疫マウスに1:40以上の中和抗体価が認められた。グループあたり4匹のマウスを用いて1ug、10ugあるいは100ugのpcD2MEによる2回の免疫が、2次抗体応答に及ぼす影響を調べた。攻撃前には、100ugのpcD2ME免疫群の2匹に、中和抗体が認められた。攻撃後、100ugのpcD2ME免疫群においては中和抗体価が1:40または1:80にまで上昇したが、1ugあるいは10ugのpcD2ME免疫群においては、8日目に最大1:20の中和抗体価を示したにとどまった。(3)450ugのpcJEMEをブタの筋肉内接種して得られた中和抗体価及びHAI抗体価の推移を、同じ量のpcJEMEを皮内接種して得られた抗体価の推移と比較した。皮内接種グループにおける中和抗体価は、初回接種後に<1:10、追加接種後1週目に1:40であり、またHAI抗体価は、初回接種後に<1:10から1:10、追加接種後1週目に1:40であった。450ugのpNJEMEを筋肉内接種することによりブタに誘導された中和抗体及びHAI抗体は、450ugのpcJEMEを筋肉内接種して得られた中和抗体及びHAI抗体と同等であった。(4)カニクイザルの感染実験を行った。3株のJEVをカニクイザルに経鼻接種したところ,いずれの株を接種したサルにおいても感染後12-15日に全てのサルが衰弱、振戦などの症状を呈し日本脳炎として典型的な症状を呈した。病理学的には、すべての個体において日本脳炎ウイルスによると考えられる脳脊髄炎が認められた。詳細には、前例で大脳皮質、視床、中脳の黒質、赤核、橋等に神経細胞の変性や壊死がみとめられた。免疫組織学的に日本脳炎ウイルス抗原が,神経細胞細胞質内に検出された。
pcJEME免疫マウスにおける重要な防御因子は、攻撃後に誘導される中和抗体であることが証明された。このマウスモデルにおいては、防御されたマウスにおいても抗NS1抗体が検出され、たとえ攻撃前に中和抗体が存在しても、攻撃ウイルスによる感染・複製が起こったことを示す。デングワクチンの防御効力を調べるために、従来免疫マウスに攻撃ウイルスを脳内接種す方法が一般的に用いられてきた。末梢からの攻撃は、ウイルスの1次増殖及び2次増殖をもたらすと考えられるが、デングの場合通常この接種経路で病気や死を引き起こすことは不可能とされる。日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチンの有効性をサルにおいて明らかにするための前段階として、カニクイザルの日本脳炎ウイルスに対する感受性を調べたところ、経鼻感染により、カニクイザルは脳脊髄炎を発症し、斃死することが明らかとなった。現在免疫学的、ウイルス学的パラメーターを測定中ではあるが、DNAワクチンの効果判定を行ううえで極めて重要なサルにおける攻撃実験が可能であることが明らかになった。従って、このシステムを用いて、試作DNAワクチンの有効性試験を行う予定である。
抗体は大部分のマウスにおいて攻撃後4日目に最大値となった。ほとんどすべてのマウスにおいて抗NS1抗体価は観察期間中上昇し、特に数匹のマウスにおいては死の直前に急激な上昇が認められた。(2)pcD2MEをBALB/cマウスに2週間隔で2回から3回筋肉内接種した。100ugのpcD2MEにより2回免疫したマウスには、抗体価が1:10の中和抗体が誘導された。一方、1ugあるいは10ugのpcD2MEを2回免疫したマウスには、検出できる中和抗体は誘導されなかった。免疫マウスをNGC株により腹腔内接種した後の、中和抗体の推移を調べた。100ugのpcD2MEにより3回免疫した5匹のマウスの内1匹に1:10の中和抗体価が攻撃前に認められた。攻撃後、すべての免疫マウスに1:40以上の中和抗体価が認められた。グループあたり4匹のマウスを用いて1ug、10ugあるいは100ugのpcD2MEによる2回の免疫が、2次抗体応答に及ぼす影響を調べた。攻撃前には、100ugのpcD2ME免疫群の2匹に、中和抗体が認められた。攻撃後、100ugのpcD2ME免疫群においては中和抗体価が1:40または1:80にまで上昇したが、1ugあるいは10ugのpcD2ME免疫群においては、8日目に最大1:20の中和抗体価を示したにとどまった。(3)450ugのpcJEMEをブタの筋肉内接種して得られた中和抗体価及びHAI抗体価の推移を、同じ量のpcJEMEを皮内接種して得られた抗体価の推移と比較した。皮内接種グループにおける中和抗体価は、初回接種後に<1:10、追加接種後1週目に1:40であり、またHAI抗体価は、初回接種後に<1:10から1:10、追加接種後1週目に1:40であった。450ugのpNJEMEを筋肉内接種することによりブタに誘導された中和抗体及びHAI抗体は、450ugのpcJEMEを筋肉内接種して得られた中和抗体及びHAI抗体と同等であった。(4)カニクイザルの感染実験を行った。3株のJEVをカニクイザルに経鼻接種したところ,いずれの株を接種したサルにおいても感染後12-15日に全てのサルが衰弱、振戦などの症状を呈し日本脳炎として典型的な症状を呈した。病理学的には、すべての個体において日本脳炎ウイルスによると考えられる脳脊髄炎が認められた。詳細には、前例で大脳皮質、視床、中脳の黒質、赤核、橋等に神経細胞の変性や壊死がみとめられた。免疫組織学的に日本脳炎ウイルス抗原が,神経細胞細胞質内に検出された。
pcJEME免疫マウスにおける重要な防御因子は、攻撃後に誘導される中和抗体であることが証明された。このマウスモデルにおいては、防御されたマウスにおいても抗NS1抗体が検出され、たとえ攻撃前に中和抗体が存在しても、攻撃ウイルスによる感染・複製が起こったことを示す。デングワクチンの防御効力を調べるために、従来免疫マウスに攻撃ウイルスを脳内接種す方法が一般的に用いられてきた。末梢からの攻撃は、ウイルスの1次増殖及び2次増殖をもたらすと考えられるが、デングの場合通常この接種経路で病気や死を引き起こすことは不可能とされる。日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチンの有効性をサルにおいて明らかにするための前段階として、カニクイザルの日本脳炎ウイルスに対する感受性を調べたところ、経鼻感染により、カニクイザルは脳脊髄炎を発症し、斃死することが明らかとなった。現在免疫学的、ウイルス学的パラメーターを測定中ではあるが、DNAワクチンの効果判定を行ううえで極めて重要なサルにおける攻撃実験が可能であることが明らかになった。従って、このシステムを用いて、試作DNAワクチンの有効性試験を行う予定である。
結論
(1)pcJEME免疫マウスにおける重要な防御因子は、攻撃後に誘導される中和抗体であるとが証明された。(2)デング2型ウイルスNGC株のシグナル/prM/E遺伝子カセットをpcDNA3ベクターに組込むことにより作製したプラスミド(pcD2ME)は、マウスにおいて中和抗体及びデング2型ウイルス特異的な記憶B細胞を誘導することが明らかにされた。(3)日本脳炎ウイルス(JEV)のシグナル、前駆膜(prM)及び外被膜(E)遺伝子からなるカセットをpcDNA3 及びpNGVL4aベクターに組込んで作製したプラスミド(pcJEME及びpNJEME)は、ブタにおいて中和抗体、HAI抗体及び記憶B細胞を誘導することが明らかにされた。(4)カニクイザルは日本脳炎ウイルスの経鼻接種に高い感受性を示し、ワクチンの有効性をしるための攻撃実験に有用であることが、明らかとなった。
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