文献情報
文献番号
199800489A
報告書区分
総括
研究課題名
細菌の薬剤耐性機構の分子解析と耐性機序別迅速検出法に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成10(1998)年度
研究代表者(所属機関)
藤原 博(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 荒川宜親(国立感染症研究所)
- 渡辺治雄(国立感染症研究所)
- 池 康嘉(群馬大医学部微生物)
- 堀田國元(国立感染症研究所)
- 井上松久(北里大学微生物学)
- 澤井哲夫(千葉大学薬学部微生物薬品化学)
- 中江大治(東海大学分子生命科学)
- 山口恵三(東邦大学医学部微生物学)
- 中島良徳(北海道薬科大学微生物学)
- 渡邊邦友(岐阜大学医学部附属嫌気性菌実験施設)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
18,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
我が国は1970年代から各種の細菌に強力な抗菌活性を示す様々な抗菌薬の開発の先頭に立ってきた。そして、細菌感染症の治療は大きく進歩した。しかし、1980年代に入るとMRSAをはじめ種々の薬剤耐性菌による院内感染症や術後感染症が問題となり、現在、薬剤耐性菌による感染症は臨床的に大きな脅威となっている。特に、我が国では、欧米で未だ一般的ではない多数の「新薬」が認可・使用されており、また、それらは比較的自由に用いることができるため、欧米では未だ出現していないような新手の薬剤耐性菌が出現しつつある。これらの薬剤耐性菌による院内感染症や術後感染症に対し適切な対策を講じるためには、臨床材料等から迅速にこれらの耐性菌を検出したり識別する事が不可欠となっている。本研究では、新しい耐性菌における薬剤耐性機構の分子解析を通じて、臨床的に問題となる種々の薬剤耐性菌を迅速かつ簡便に検出する方法の確立をを目指している。
研究方法
1. 国内分離菌からのESBL遺伝子の検出
関東地区の一医療施設で分離された、CAZ耐性K. pneumoniae HKY402株を選び、定法に従い、DNAを抽出し、制限酵素(BamHI)処理をしたのち、同じ酵素で処理した、プラスミドベクターpMK16に組み込み、E. coli HB101を形質転換し、CAZ耐性コロニーを選択し、組み替え体プラスミドに組み込まれた約3.5 kbのDNA断片の塩基配列の決定を行った。
2. メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の簡易識別法の確立
メタロ-β-ラクタマーゼを産生するP. aeruginosa, S. marcescens, K. pneumoniaeを用い、CAZを含む感受性試験用の試験ディスクとメタロ-β-ラクタマーゼの特異的阻害剤を含むろ紙片を組み合わせ、通常のNCCLSの方式を用いることで、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便にかつ特異的に識別する方法を検討した。阻害剤としては、各種の重金属塩(CuCl2など)やEDTAなどの金属キレート剤、また、各種のメルカプト化合物や含硫化合物を用いた。具体的には、NCCLSの感受性試験法に基づき、被菌液をMH寒天培地に綿棒で塗布し、その上にCAZの感受性試験用ディスク2個を4 cm離して置く。一方のCAZのディスクから2 cm程離して直径数mmのろ紙片を置き、これに阻害剤を加え、一夜、37℃で静置培養し阻止円の形状の変化から、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判定する。
3. 黄色ブドウ球菌のテイコプラニン耐性遺伝子
大腸菌のFプラスミド複製開始点と枯草菌のpAMα1複製開始点を持つシャトルベクターpAW13を用い、テイコプラニン(TEIC)感受性実験室株BB255(MIC, 1.5 mg/L)の染色体ライブラリーを作成した。コノライヅラリーDNAを別の実験室株RN4220に導入した後、phage80αを用いて、TEIC耐性株BB938に再度導入し、得られた72の形質導入株のTEICに対する感受性をしらべた。
4. 臨床分離黄色ブドウ球菌のマクロライド耐性
臨床分離黄色ブドウ球菌よりマクロライド不活化遺伝子mphBMを世界に先がけ見出した。そこで、臨床分離黄色ブドウ球菌における本遺伝子の保有状況をPCR/サザンハイブリダイゼーション法により調査した。一方、マクロライド耐性黄色ブドウ球菌の90%以上はerm遺伝子を保有していることから、起因菌の分離培養を行うことなく、耳腔及び鼻腔拭い液からのerm遺伝子のPCR法による直接高感度検出法の検討を行った。
5. 喀痰材料からのβ-ラクラマーゼの直接的検出
喀痰にリン酸緩衝液を添加してホモジネート後、超遠心して喀痰中β-lactamaseを抽出した。
β-lactamase活性は基質としてニトロセフィンを用いてUV法で測定した。すなわち、自記吸光光度計を用いて1分間酵素液とその基質液を反応させてその間の吸光度の変化を計測した。得られた吸光度の変化をグラフにミカエリス・メンテンのプロットを行い、酵素学的パラメータを算出した。
6. PCaseTESTの改良によるβ-ラクタマーゼのクラス分類
何らかのβ-ラクタマーゼを産生する臨床分離大腸菌(87株)のABPC, ABPC/CVA, PIPC, PIPC/CVA, CET, CTM, CAZ, CTX, AZT, CFPM, CMZ, CPDX, IPMなどに対する薬剤感受性を測定した。更に全株から粗酵素液を抽出してUV法により酵素のクラス分類
を行った。これらの菌株について改良型PCaseTESTを用いた迅速診断の結果と薬剤感受性結果から産生酵素の同定を試み、UV法による同定結果と比較してその特異性を検討した。
7. 抗OprM抗体による薬剤汲み出し型耐性菌の検出
寒天固形培地上に成育した菌を、A6001cm=0.15の間になるよう50mMリン酸緩衝液pH7.0に浮遊した。この菌浮遊液を2倍希釈により連続的に希釈し、これを0.1%のSPSを含む緩衝液中で100℃1分加熱した後にその各々の100μlを吸引によりメンブレン上に吸着させた。この膜を先に調成しておいた抗OprM抗体で75分間処理した後2次抗体を30分作用させ、30分間発色反応を行った。
8. アルベカシン耐性MRSAの耐性遺伝子の検出
アルベカシン(ABK)耐性MRSAの2種の耐性遺伝子[メチシリン耐性遺伝子mecAとABK耐性遺伝子aac(6')/aph(2")]を一度のPCRによって検出するための条件を検討・確立した。その方法を用いて、全国コレクションのABK耐性臨床分離株(MRSA33株と未同定株10株)を対象に両遺伝子の存否を検索し、ABK耐性および菌学的性状との相関性を調べた。
9. Bacteroides fragilisのカルバペネム耐性遺伝子の解析
B. fragilis臨床分離株を用い、MICは米国のNCCLSの方法に従い寒天平板希釈法で測定した。メタロベータラクタメースはUV法とバイオアッセイで検出した。cfiAの直上流にあるinsersion element (IS)の塩基配列決定はcfiAを有し、メタロベータラクタメース産生株について行った。ISはPodglajenらが報告したIS の直上流の塩基配列から選んだforward primer GとcfiAの5'末端近傍を含むreverse primer Eを用いてPCRで増幅して得た。
10. VREのvan遺伝子クラスターの解析
臨床分離されたVREと鶏肉などから分離されたVREの遺伝学的関連を解析するため、この領域に存在する各遺伝子の配列を決定し、既に報告されているVCM耐性トランスポゾンTn1546のそれと比較検討を行った。
11. 病原細菌の産生するβ-ラクタマーゼのクラス鑑別法
臨床分離される細菌が、どのクラスのβ-ラクタマーゼを産生しているかを、β-ラクタマーゼ阻害作用を示す物質(クラブラン酸、Syn2161、J110,441)を用いて識別する方法を検討した。MIC測定は、一般的な微量液体希釈法の他に、ルシフェラーゼ発光法(ATP法)を改良したMIC迅速測定法を試みた。
関東地区の一医療施設で分離された、CAZ耐性K. pneumoniae HKY402株を選び、定法に従い、DNAを抽出し、制限酵素(BamHI)処理をしたのち、同じ酵素で処理した、プラスミドベクターpMK16に組み込み、E. coli HB101を形質転換し、CAZ耐性コロニーを選択し、組み替え体プラスミドに組み込まれた約3.5 kbのDNA断片の塩基配列の決定を行った。
2. メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の簡易識別法の確立
メタロ-β-ラクタマーゼを産生するP. aeruginosa, S. marcescens, K. pneumoniaeを用い、CAZを含む感受性試験用の試験ディスクとメタロ-β-ラクタマーゼの特異的阻害剤を含むろ紙片を組み合わせ、通常のNCCLSの方式を用いることで、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便にかつ特異的に識別する方法を検討した。阻害剤としては、各種の重金属塩(CuCl2など)やEDTAなどの金属キレート剤、また、各種のメルカプト化合物や含硫化合物を用いた。具体的には、NCCLSの感受性試験法に基づき、被菌液をMH寒天培地に綿棒で塗布し、その上にCAZの感受性試験用ディスク2個を4 cm離して置く。一方のCAZのディスクから2 cm程離して直径数mmのろ紙片を置き、これに阻害剤を加え、一夜、37℃で静置培養し阻止円の形状の変化から、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌か否かを判定する。
3. 黄色ブドウ球菌のテイコプラニン耐性遺伝子
大腸菌のFプラスミド複製開始点と枯草菌のpAMα1複製開始点を持つシャトルベクターpAW13を用い、テイコプラニン(TEIC)感受性実験室株BB255(MIC, 1.5 mg/L)の染色体ライブラリーを作成した。コノライヅラリーDNAを別の実験室株RN4220に導入した後、phage80αを用いて、TEIC耐性株BB938に再度導入し、得られた72の形質導入株のTEICに対する感受性をしらべた。
4. 臨床分離黄色ブドウ球菌のマクロライド耐性
臨床分離黄色ブドウ球菌よりマクロライド不活化遺伝子mphBMを世界に先がけ見出した。そこで、臨床分離黄色ブドウ球菌における本遺伝子の保有状況をPCR/サザンハイブリダイゼーション法により調査した。一方、マクロライド耐性黄色ブドウ球菌の90%以上はerm遺伝子を保有していることから、起因菌の分離培養を行うことなく、耳腔及び鼻腔拭い液からのerm遺伝子のPCR法による直接高感度検出法の検討を行った。
5. 喀痰材料からのβ-ラクラマーゼの直接的検出
喀痰にリン酸緩衝液を添加してホモジネート後、超遠心して喀痰中β-lactamaseを抽出した。
β-lactamase活性は基質としてニトロセフィンを用いてUV法で測定した。すなわち、自記吸光光度計を用いて1分間酵素液とその基質液を反応させてその間の吸光度の変化を計測した。得られた吸光度の変化をグラフにミカエリス・メンテンのプロットを行い、酵素学的パラメータを算出した。
6. PCaseTESTの改良によるβ-ラクタマーゼのクラス分類
何らかのβ-ラクタマーゼを産生する臨床分離大腸菌(87株)のABPC, ABPC/CVA, PIPC, PIPC/CVA, CET, CTM, CAZ, CTX, AZT, CFPM, CMZ, CPDX, IPMなどに対する薬剤感受性を測定した。更に全株から粗酵素液を抽出してUV法により酵素のクラス分類
を行った。これらの菌株について改良型PCaseTESTを用いた迅速診断の結果と薬剤感受性結果から産生酵素の同定を試み、UV法による同定結果と比較してその特異性を検討した。
7. 抗OprM抗体による薬剤汲み出し型耐性菌の検出
寒天固形培地上に成育した菌を、A6001cm=0.15の間になるよう50mMリン酸緩衝液pH7.0に浮遊した。この菌浮遊液を2倍希釈により連続的に希釈し、これを0.1%のSPSを含む緩衝液中で100℃1分加熱した後にその各々の100μlを吸引によりメンブレン上に吸着させた。この膜を先に調成しておいた抗OprM抗体で75分間処理した後2次抗体を30分作用させ、30分間発色反応を行った。
8. アルベカシン耐性MRSAの耐性遺伝子の検出
アルベカシン(ABK)耐性MRSAの2種の耐性遺伝子[メチシリン耐性遺伝子mecAとABK耐性遺伝子aac(6')/aph(2")]を一度のPCRによって検出するための条件を検討・確立した。その方法を用いて、全国コレクションのABK耐性臨床分離株(MRSA33株と未同定株10株)を対象に両遺伝子の存否を検索し、ABK耐性および菌学的性状との相関性を調べた。
9. Bacteroides fragilisのカルバペネム耐性遺伝子の解析
B. fragilis臨床分離株を用い、MICは米国のNCCLSの方法に従い寒天平板希釈法で測定した。メタロベータラクタメースはUV法とバイオアッセイで検出した。cfiAの直上流にあるinsersion element (IS)の塩基配列決定はcfiAを有し、メタロベータラクタメース産生株について行った。ISはPodglajenらが報告したIS の直上流の塩基配列から選んだforward primer GとcfiAの5'末端近傍を含むreverse primer Eを用いてPCRで増幅して得た。
10. VREのvan遺伝子クラスターの解析
臨床分離されたVREと鶏肉などから分離されたVREの遺伝学的関連を解析するため、この領域に存在する各遺伝子の配列を決定し、既に報告されているVCM耐性トランスポゾンTn1546のそれと比較検討を行った。
11. 病原細菌の産生するβ-ラクタマーゼのクラス鑑別法
臨床分離される細菌が、どのクラスのβ-ラクタマーゼを産生しているかを、β-ラクタマーゼ阻害作用を示す物質(クラブラン酸、Syn2161、J110,441)を用いて識別する方法を検討した。MIC測定は、一般的な微量液体希釈法の他に、ルシフェラーゼ発光法(ATP法)を改良したMIC迅速測定法を試みた。
結果と考察
1. 国内分離菌からのESBL遺伝子の検出
CAZ耐性K. pneumoniae HKY402株からクローニングしたβ-ラクタマーゼの遺伝子の周辺の塩基配列を決定した結果、遺伝子の配置は図2に示す如くであった。また、遺伝子から推定されるアミノ酸配列をデーターベースと照合したところ、欧米で報告されている、SHV-5a型ESBLと一致した=。
2. メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の識別法の確立
メタロ-β-ラクタマーゼを阻害する様々な物質について検討した結果、メルカプトプロピオン酸、あるいはメルカプト酢酸を用いた場合、最も良い結果が得られることが判明した。試験結果の例を、図4に示す。
この方法を用いることにより、PCR法などの方法を用いることなく、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌をESBL産生菌やAmpC産生菌と識別することが可能となった。3. 黄色ブドウ球菌のテイコプラニン耐性遺伝子
TEIC感受性株TPS42とTPS62 (ともにMIC, 3 mg/L)の染色体を、パルスフィールドゲル電気泳動で解析したところ、TPS42ではTEIC感受性株由来のSmaI-DとSmaI-L DNA断片の一部が、TPS62ではTEIC感受性株由来のSmaI-Iの一部が、BB938に導入され、この株をTEICに対して感受性にしていることがわかった。この結果、黄色ブドウ球菌のTEIC耐性に影響を与える遺伝子が、これらの断片上に存在し、感受性有意に働いていると考えられる。
4. 臨床分離黄色ブドウ球菌のマクロライド耐性
PCR法によるmphBM遺伝子の検出で、臨床分離マクロライド耐性黄色ブドウ球菌177株中、11株に増幅産物が得られた。しかし、当該産物にmphBMをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ全て陰性であり、mphBM保有マクロライド耐性黄色ブドウ球菌は蔓延していないことが示唆された。
一方、臨床検体からのerm遺伝子直接検出は、耳腔拭い液では直接熱抽出で、鼻腔拭い液ではジチオスレイトール処理後熱抽出法により10×E2オーダーの菌量で検出が可能であった。
5. 喀痰材料からのβ-ラクラマーゼの直接的検出
喀痰からβ-lactamaseを抽出するまでに要する時間は約30分であった。緑膿菌の場合は、喀痰中10×E5 cfu/ml 程度の菌量が存在すればβ-lactamaseの活性を検出することができた。一方、β-lactamase非産生菌の場合、10×E6 cfu/ml の菌量が喀痰中に存在しても吸光度に変化が認められなかった。得られた吸光度変化から酵素学的パラメータを算出したところ、その酵素がどのようなβ-lactamaseなのか推定することが可能であった。
6. PCaseTESTの改良によるβ-ラクタマーゼのクラス分類
産生酵素の種類についてUV法を用いて同定を行ったところ、Class Aβ-ラクタマーゼ(ESBLsを除く)産生菌22株、 Class Aβ-ラクタマーゼ(ESBLs)産生菌21株、ClassCβ-ラクタマーゼ産生菌37株、Class A+Class C産生菌6株、ESBL+ Class C産生菌1株
であった。これらの株についてCFPMのMIC(ブレイクポイント≧2μg/ml )と改良型PCaseTESTの結果を用いると全体で99%の株について産生酵素クラスの同定が可能であった。
7. 抗OprM抗体による薬剤汲み出し型耐性菌の検出
L-agar培地上に生育した野性株のコロニーをかき取りそれから菌の浮遊液A600=0.15 程度を調製し、これの100μlをメンブレン上に吸着させたとき陽性反応が得られた。
MexA,B-OprMの発現が亢進していることが明らかとなっている株では共に上記濃度の菌液を8倍希釈をした時に親株と同程度の陽性度を示した。これらの変異菌のOFLX、CP及びCPRに対するMICは各々に野生株の8、8、4倍程度であるのでMICとOprMの発現の相関は非常に高かった。
8. アルベカシン耐性MRSAの耐性遺伝子の検出
MRSA株ではいずれもmec遺伝子が検出されたが、ABK耐性遺伝子に関しては23株しか検出されなかった。未同定株では10株いずれにもmec遺伝子は検
出されず、5株においてABK耐性遺伝子が検出された。一方、抗生物質耐性試験の結果、MRSAではアルベカシン耐性とABK耐性遺伝子との間に相関性が認められた。未同定株では、ABK耐性とaac(6')/aph(2")遺伝子の間に相関性がなく、菌学的性状試験によって菌株はすべて腸球菌と判定された。
9. Bacteroides fragilisのカルバペネム耐性遺伝子の解析
イミペネム耐性遺伝子であるcfiAの直上流にあるIS をprimer GとEを用いたPCRで検 出したところ、cfiA陽性のすべてのイミペネム耐性株で、約2-kbpのPCR産物が得られた。PCR産物の塩基配列決定により、5菌株から5種類のIS-like elementが検出され
たが、2種類は99.6%の類似性を示したことから、同じ遺伝子であると思われた。決定された塩基配列からプライマーを選び、PCRを行った所、2種類のIS-like elementが特異的に検出された。
10.VREのvan遺伝子クラスターの解析
鶏肉由来のVRE(CB26株)とヒト由来臨床分離株(FN1)のvan遺伝子領域は、Tn1546と同様に7個の遺伝子で構成されていた。各々のvan遺伝子をTn1546のそれらと比較した場合、CB26においてはvanH, A, X, Y, Zの5つの遺伝子が、FN1 においてはvanH, A, X, Z の4つの遺伝子がTn1546の遺伝子と同一の塩基配列を示すことが明らかとなった。
11. 病原細菌の産生するβ-ラクタマーゼのクラス鑑別法
クラス及び酵素的性質の明らかな7菌種14株のβ-ラクタマーゼ産生菌を対象に、阻害剤を用いた試験を行った。その結果、クラスAに属するβ-ラクタマーゼは、CVAによってのみ阻害を受け、クラスCに属するβ-ラクタマーゼは、CVAとSyn2161によって阻害を受けた。また、クラスBに属するメタロ-β-ラクタマーゼは、CVAとSyn2161によって阻害を受けず、J110,441によってのみ阻害を受けた。しかし、クラスDに属するOXA型β-ラクタマーゼは、Syn2161とJ110,441によって阻害を受けず、CVAによってのみ阻害を受け、クラスAに属するβ-ラクタマーゼと識別が困難であった。拡張型のクラスCβ-ラクタマーゼは、CVAによってのみ弱く阻害を受けるという特徴が見られた。この結果、これらの薬剤を用いることによりβ-ラクタマーゼのクラスを推定することが概ね可能であった。しかし、特異性を高める為には、さらに改良を試みる必要がある。
ルシフェラーゼ発光法により、MIC値の判定時間を5分の1以下(3時間30分)に短縮することが可能であった。
本研究班は、平成9年度から平成11年度の3年計画で、研究を進めているが、既に、SHV-5a型ESBLを産生するCAZ耐性K. pneumoniae の存在を国内ではじめて確認し、さらに、マクロライド不活化遺伝子mphBMを保有する臨床分離黄色ブドウ球菌が世界ではじめて確認されるなどの成果が挙がっている。一方、臨床で問題となりつつあるIMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を、PCR法などの高価な検査法を用いることなく簡便に識別する方法を確立し、検査室で実施可能なPCRにかわる確認試験法として、キット化が検討されている。
その他にも、実用化が期待できる新しい迅速検出法の研究も複数進行中であり、平成11年度末までには、さらなる研究成果が期待されている。
細菌全般において多剤耐性菌や高度耐性菌などが増えており、細菌感染症を治療する上で脅威となりつつある。現在の検査体制では、臨床分離される細菌がどのような耐性傾向を獲得しているかを判別するのに、少なくとも1両日を要し、結果が得られた頃には患者が急変し手遅れとなっている場合も有る。また、VREなどを保菌する新規受け入れ患者の発見が遅れた場合、同室者等への二次感染や院内環境の広範な汚染が引き起こされる危険性がある。このような事態を防ぐためには、患者の臨床材料中にどのような薬剤耐性菌が存在するかを、短時間に検出・識別する検査法の確立が必要となっており、国民の健康的医療環境を保障する上でも、本研究班のような研究班を厚生科学研究として維持することは重要と考えられる。
CAZ耐性K. pneumoniae HKY402株からクローニングしたβ-ラクタマーゼの遺伝子の周辺の塩基配列を決定した結果、遺伝子の配置は図2に示す如くであった。また、遺伝子から推定されるアミノ酸配列をデーターベースと照合したところ、欧米で報告されている、SHV-5a型ESBLと一致した=。
2. メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌の識別法の確立
メタロ-β-ラクタマーゼを阻害する様々な物質について検討した結果、メルカプトプロピオン酸、あるいはメルカプト酢酸を用いた場合、最も良い結果が得られることが判明した。試験結果の例を、図4に示す。
この方法を用いることにより、PCR法などの方法を用いることなく、メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌をESBL産生菌やAmpC産生菌と識別することが可能となった。3. 黄色ブドウ球菌のテイコプラニン耐性遺伝子
TEIC感受性株TPS42とTPS62 (ともにMIC, 3 mg/L)の染色体を、パルスフィールドゲル電気泳動で解析したところ、TPS42ではTEIC感受性株由来のSmaI-DとSmaI-L DNA断片の一部が、TPS62ではTEIC感受性株由来のSmaI-Iの一部が、BB938に導入され、この株をTEICに対して感受性にしていることがわかった。この結果、黄色ブドウ球菌のTEIC耐性に影響を与える遺伝子が、これらの断片上に存在し、感受性有意に働いていると考えられる。
4. 臨床分離黄色ブドウ球菌のマクロライド耐性
PCR法によるmphBM遺伝子の検出で、臨床分離マクロライド耐性黄色ブドウ球菌177株中、11株に増幅産物が得られた。しかし、当該産物にmphBMをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ全て陰性であり、mphBM保有マクロライド耐性黄色ブドウ球菌は蔓延していないことが示唆された。
一方、臨床検体からのerm遺伝子直接検出は、耳腔拭い液では直接熱抽出で、鼻腔拭い液ではジチオスレイトール処理後熱抽出法により10×E2オーダーの菌量で検出が可能であった。
5. 喀痰材料からのβ-ラクラマーゼの直接的検出
喀痰からβ-lactamaseを抽出するまでに要する時間は約30分であった。緑膿菌の場合は、喀痰中10×E5 cfu/ml 程度の菌量が存在すればβ-lactamaseの活性を検出することができた。一方、β-lactamase非産生菌の場合、10×E6 cfu/ml の菌量が喀痰中に存在しても吸光度に変化が認められなかった。得られた吸光度変化から酵素学的パラメータを算出したところ、その酵素がどのようなβ-lactamaseなのか推定することが可能であった。
6. PCaseTESTの改良によるβ-ラクタマーゼのクラス分類
産生酵素の種類についてUV法を用いて同定を行ったところ、Class Aβ-ラクタマーゼ(ESBLsを除く)産生菌22株、 Class Aβ-ラクタマーゼ(ESBLs)産生菌21株、ClassCβ-ラクタマーゼ産生菌37株、Class A+Class C産生菌6株、ESBL+ Class C産生菌1株
であった。これらの株についてCFPMのMIC(ブレイクポイント≧2μg/ml )と改良型PCaseTESTの結果を用いると全体で99%の株について産生酵素クラスの同定が可能であった。
7. 抗OprM抗体による薬剤汲み出し型耐性菌の検出
L-agar培地上に生育した野性株のコロニーをかき取りそれから菌の浮遊液A600=0.15 程度を調製し、これの100μlをメンブレン上に吸着させたとき陽性反応が得られた。
MexA,B-OprMの発現が亢進していることが明らかとなっている株では共に上記濃度の菌液を8倍希釈をした時に親株と同程度の陽性度を示した。これらの変異菌のOFLX、CP及びCPRに対するMICは各々に野生株の8、8、4倍程度であるのでMICとOprMの発現の相関は非常に高かった。
8. アルベカシン耐性MRSAの耐性遺伝子の検出
MRSA株ではいずれもmec遺伝子が検出されたが、ABK耐性遺伝子に関しては23株しか検出されなかった。未同定株では10株いずれにもmec遺伝子は検
出されず、5株においてABK耐性遺伝子が検出された。一方、抗生物質耐性試験の結果、MRSAではアルベカシン耐性とABK耐性遺伝子との間に相関性が認められた。未同定株では、ABK耐性とaac(6')/aph(2")遺伝子の間に相関性がなく、菌学的性状試験によって菌株はすべて腸球菌と判定された。
9. Bacteroides fragilisのカルバペネム耐性遺伝子の解析
イミペネム耐性遺伝子であるcfiAの直上流にあるIS をprimer GとEを用いたPCRで検 出したところ、cfiA陽性のすべてのイミペネム耐性株で、約2-kbpのPCR産物が得られた。PCR産物の塩基配列決定により、5菌株から5種類のIS-like elementが検出され
たが、2種類は99.6%の類似性を示したことから、同じ遺伝子であると思われた。決定された塩基配列からプライマーを選び、PCRを行った所、2種類のIS-like elementが特異的に検出された。
10.VREのvan遺伝子クラスターの解析
鶏肉由来のVRE(CB26株)とヒト由来臨床分離株(FN1)のvan遺伝子領域は、Tn1546と同様に7個の遺伝子で構成されていた。各々のvan遺伝子をTn1546のそれらと比較した場合、CB26においてはvanH, A, X, Y, Zの5つの遺伝子が、FN1 においてはvanH, A, X, Z の4つの遺伝子がTn1546の遺伝子と同一の塩基配列を示すことが明らかとなった。
11. 病原細菌の産生するβ-ラクタマーゼのクラス鑑別法
クラス及び酵素的性質の明らかな7菌種14株のβ-ラクタマーゼ産生菌を対象に、阻害剤を用いた試験を行った。その結果、クラスAに属するβ-ラクタマーゼは、CVAによってのみ阻害を受け、クラスCに属するβ-ラクタマーゼは、CVAとSyn2161によって阻害を受けた。また、クラスBに属するメタロ-β-ラクタマーゼは、CVAとSyn2161によって阻害を受けず、J110,441によってのみ阻害を受けた。しかし、クラスDに属するOXA型β-ラクタマーゼは、Syn2161とJ110,441によって阻害を受けず、CVAによってのみ阻害を受け、クラスAに属するβ-ラクタマーゼと識別が困難であった。拡張型のクラスCβ-ラクタマーゼは、CVAによってのみ弱く阻害を受けるという特徴が見られた。この結果、これらの薬剤を用いることによりβ-ラクタマーゼのクラスを推定することが概ね可能であった。しかし、特異性を高める為には、さらに改良を試みる必要がある。
ルシフェラーゼ発光法により、MIC値の判定時間を5分の1以下(3時間30分)に短縮することが可能であった。
本研究班は、平成9年度から平成11年度の3年計画で、研究を進めているが、既に、SHV-5a型ESBLを産生するCAZ耐性K. pneumoniae の存在を国内ではじめて確認し、さらに、マクロライド不活化遺伝子mphBMを保有する臨床分離黄色ブドウ球菌が世界ではじめて確認されるなどの成果が挙がっている。一方、臨床で問題となりつつあるIMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を、PCR法などの高価な検査法を用いることなく簡便に識別する方法を確立し、検査室で実施可能なPCRにかわる確認試験法として、キット化が検討されている。
その他にも、実用化が期待できる新しい迅速検出法の研究も複数進行中であり、平成11年度末までには、さらなる研究成果が期待されている。
細菌全般において多剤耐性菌や高度耐性菌などが増えており、細菌感染症を治療する上で脅威となりつつある。現在の検査体制では、臨床分離される細菌がどのような耐性傾向を獲得しているかを判別するのに、少なくとも1両日を要し、結果が得られた頃には患者が急変し手遅れとなっている場合も有る。また、VREなどを保菌する新規受け入れ患者の発見が遅れた場合、同室者等への二次感染や院内環境の広範な汚染が引き起こされる危険性がある。このような事態を防ぐためには、患者の臨床材料中にどのような薬剤耐性菌が存在するかを、短時間に検出・識別する検査法の確立が必要となっており、国民の健康的医療環境を保障する上でも、本研究班のような研究班を厚生科学研究として維持することは重要と考えられる。
結論
バンコマイシン、広域β-ラクタム薬、アミノグリコシド薬、マクロライド薬などへの耐性機序や耐性菌の検出法などについて、多方面から研究が行われた。その結果
・SHV-5a型ESBLを産生するセフタジジム(CAZ)耐性K. pneumoniae の存在を国内ではじめて確認した。
・マクロライド不活化遺伝子mphBMを保有する臨床分離黄色ブドウ球菌が世界ではじめて確認された。
・黄色ブドウ球菌においてテイコプラニンの耐性に関与する遺伝子の染色体上の大まかな位置を確認した。
また、新しい検査法の開発として、以下の成果が挙げられた。
・IMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便に識別する方法の確立。
・β-lactamaseを喀痰から直接、迅速に抽出し酵素学的な解析を行う方法の開発。
・アルベカシン耐性MRSAからmecAとaac(6')/aph(2")の両遺伝子を同時に検出する方法の開発。
・PCaseTESTの改良により、大腸菌の産生する酵素のクラスを30分以内に迅速に同定する方法の開発。
・抗OprM抗体を用いたウエスタンブロット法によりMexA,B-OprM排出ポンプの高発現多剤交叉耐性株を検出する方法の開発。
特に
・のIMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便に識別する方法については、特許申請を行い、実際に臨床検査の現場での実用化を目指してキット化を検討している。
・SHV-5a型ESBLを産生するセフタジジム(CAZ)耐性K. pneumoniae の存在を国内ではじめて確認した。
・マクロライド不活化遺伝子mphBMを保有する臨床分離黄色ブドウ球菌が世界ではじめて確認された。
・黄色ブドウ球菌においてテイコプラニンの耐性に関与する遺伝子の染色体上の大まかな位置を確認した。
また、新しい検査法の開発として、以下の成果が挙げられた。
・IMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便に識別する方法の確立。
・β-lactamaseを喀痰から直接、迅速に抽出し酵素学的な解析を行う方法の開発。
・アルベカシン耐性MRSAからmecAとaac(6')/aph(2")の両遺伝子を同時に検出する方法の開発。
・PCaseTESTの改良により、大腸菌の産生する酵素のクラスを30分以内に迅速に同定する方法の開発。
・抗OprM抗体を用いたウエスタンブロット法によりMexA,B-OprM排出ポンプの高発現多剤交叉耐性株を検出する方法の開発。
特に
・のIMP-1型メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌を簡便に識別する方法については、特許申請を行い、実際に臨床検査の現場での実用化を目指してキット化を検討している。
公開日・更新日
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