文献情報
文献番号
201449002A
報告書区分
総括
研究課題名
モデル動物等を用いたＨＣＶ感染病態と関連する宿主・ウイルス因子の解析と新規治療法の開発に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
竹原 徹郎(国立大学法人大阪大学 大学院医学系研究科 消化器内科学)
研究分担者(所属機関)
- 阪森 亮太郎(国立大学法人大阪大学 大学院医学系研究科 消化器内科学)
- 疋田 隼人(国立大学法人大阪大学 大学院医学系研究科 消化器内科学)
- 末水 洋志(公益財団法人実験動物中央研究所 バイオメディカル研究部)
- 三善 英知(国立大学法人 大阪大学大学院医学系研究科 機能診断科学)
- 坂本 直哉(国立大学法人 北海道大学大学院医学研究科 消化器内科学)
- 加藤 孝宣(国立感染症研究所 ウイルス第二部)
- 水口 裕之(国立大学法人大阪大学 大学院薬学研究科 分子生物学分野)
- 永野 浩昭(国立大学法人山口大学 大学院医学系研究科 消化器腫瘍外科学)
- 江口 英利(国立大学法人大阪大学 大学院医学系研究科 消化器外科学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【委託費】 肝炎等克服実用化研究
研究開始年度
平成26(2014)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
34,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
C型肝炎に対する治療は、選択的な抗ウイルス薬（DAA）の登場によりSVR率の飛躍的な向上が得られるようになったが、同時に多剤耐性ウイルスの出現など新たな対応が必要である。より難治例に治療適応が拡大するなかでSVR後発がんの急増が危惧されるなど、C型肝炎に伴う病態の解明、さらに疾患進展・発がんを予測するバイオマーカーの開発が以前にも増して重要となってきている。本研究課題ではC型肝炎ウイルス（HCV）に感染性を示す新規のモデル動物、培養細胞を作出し、DAA治療による耐性克服や、HCV感染後の病態の可塑性等について検討することを目的とした。
研究方法
以下のアプローチをった。１）HCVが効率よく感染し、長期にわたって解析できる新規肝細胞キメラマウスを作成する。また日本人が持つ人種的特徴を反映した解析を行うため、日本人由来の肝細胞を用いて、肝細胞キメラマウスを作成する。２）効果的なウイルス排除治療の確立のために、HCV感染肝細胞キメラマウスに各種DAA製剤を投与し、ウイルスの変異株存在率とDAAの効果を検討する。３）キメラマウス由来のヒト初代培養肝細胞を用いて感染実験を行い、ウイルス排除機構を解明する。４）iPS細胞にCRISPR/Casシステムを用いて、免疫応答関連遺伝子を修飾した細胞を作成する。この細胞を肝細胞に分化誘導し、感染細胞として使用することでDAA製剤治療における細胞内免疫応答機構の意義を検討する。５）C型肝炎に伴う病態解明のために、HCV感染モデルを用いて遺伝子発現解析、遺伝子変異・メチル化解析、糖鎖修飾の解析を行い、HCV感染が肝線維化やがん化に与える影響を明らかにする。
遺伝子組み換えウイルス作成実験は文部科学大臣の拡散防止措置の確認の受け、その他の遺伝子組換え実験も、各研究実施機関遺伝子組換え安全委員会の承認のもと行っている。臨床検体を用いた研究は、各研究実施機関において倫理委員会の承認もと、インフォームドコンセントを得た上で行っている。動物実験は、各研究実施機関の動物実験委員会承認のもとで愛護的に行っている。
遺伝子組み換えウイルス作成実験は文部科学大臣の拡散防止措置の確認の受け、その他の遺伝子組換え実験も、各研究実施機関遺伝子組換え安全委員会の承認のもと行っている。臨床検体を用いた研究は、各研究実施機関において倫理委員会の承認もと、インフォームドコンセントを得た上で行っている。動物実験は、各研究実施機関の動物実験委員会承認のもとで愛護的に行っている。
結果と考察
ヒト肝細胞キメラTK-NOGマウスにC型肝炎患者血清を投与することにより、ウイルス血症が出現し、HCV持続感染が成立することを明らかにした。
HCVのフルゲノムRNAを肝臓に直接接種することにより、ウイルス血症が出現し、HCV持続感染が成立した。シングルクローンからのHCV感染モデルの作出に成功した。
患者血清の接種により作成したHCV持続感染マウスに、NS3/4A阻害剤、NS5A阻害剤、NS5B阻害剤を投与した。薬剤の投与により血清HCV RNA量の低下がみられ、ヒトにおける治療効果を反映するモデルとなることが示された。
肝切除検体の余剰サンプルを用いて、切除断面の門脈よりコラゲナーゼ灌流を行うことで、生細胞比率の高いヒト肝細胞の単離に成功した。
切除肝検体から単離したヒト肝細胞をTK-NOGマウスに投与することで、マウス血清からヒトアルブミンが検出された。日本人由来肝細胞を用いたヒト肝細胞キメラマウスの作成に成功した。
ヒト肝細胞キメラマウスから単離した初代培養肝細胞は長期にわたって培養可能であった。HCV患者血清を投与することでHCVの感染が成立し、培養上清中にHCVの産生を認めた。
Transthyretin (TTR) 遺伝子プロモーター作動性HSVtkトランスジェニックマウスファウンダーをNOGマウスとの交配により、今までのアルブミンプロモーター作動性のTK-NOGマウスより早期に肝細胞移植に十分な肝障害が誘導できる新規TK-NOGマウスの作出に成功した。
JFH-1株のNS5A領域を遺伝子型１b株であるCon1株に入れ替えたキメラウイルス株を作製し、さらにNS5A阻害剤の耐性変異として知られているL31とY93の変異を導入した株を作製した。これらのキメラウイルスを用い、測定したNS5A阻害剤に対するEC50値は、L31Mの変異では約4倍、L31Iでは1.4倍、L31Vでは約22倍の耐性を示した。強い耐性変異として知られているY93Hは約700倍の耐性を示した。
糖鎖バイオマーカーとして、慢性肝疾患患者の血中のフコシル化ハプトグロビンとフコシル化標的蛋白であるMac-2bpを測定した。肝細胞癌の腫瘍マーカーとしてのフコシル化ハプトグロビンの有用性と、線維化マーカーとしてのMac-2bpの有用性が示唆された。
NS3/4Aと結合する宿主蛋白であるGPx8を同定した。その他にも多数の結合候補蛋白も検出された。
HCVのフルゲノムRNAを肝臓に直接接種することにより、ウイルス血症が出現し、HCV持続感染が成立した。シングルクローンからのHCV感染モデルの作出に成功した。
患者血清の接種により作成したHCV持続感染マウスに、NS3/4A阻害剤、NS5A阻害剤、NS5B阻害剤を投与した。薬剤の投与により血清HCV RNA量の低下がみられ、ヒトにおける治療効果を反映するモデルとなることが示された。
肝切除検体の余剰サンプルを用いて、切除断面の門脈よりコラゲナーゼ灌流を行うことで、生細胞比率の高いヒト肝細胞の単離に成功した。
切除肝検体から単離したヒト肝細胞をTK-NOGマウスに投与することで、マウス血清からヒトアルブミンが検出された。日本人由来肝細胞を用いたヒト肝細胞キメラマウスの作成に成功した。
ヒト肝細胞キメラマウスから単離した初代培養肝細胞は長期にわたって培養可能であった。HCV患者血清を投与することでHCVの感染が成立し、培養上清中にHCVの産生を認めた。
Transthyretin (TTR) 遺伝子プロモーター作動性HSVtkトランスジェニックマウスファウンダーをNOGマウスとの交配により、今までのアルブミンプロモーター作動性のTK-NOGマウスより早期に肝細胞移植に十分な肝障害が誘導できる新規TK-NOGマウスの作出に成功した。
JFH-1株のNS5A領域を遺伝子型１b株であるCon1株に入れ替えたキメラウイルス株を作製し、さらにNS5A阻害剤の耐性変異として知られているL31とY93の変異を導入した株を作製した。これらのキメラウイルスを用い、測定したNS5A阻害剤に対するEC50値は、L31Mの変異では約4倍、L31Iでは1.4倍、L31Vでは約22倍の耐性を示した。強い耐性変異として知られているY93Hは約700倍の耐性を示した。
糖鎖バイオマーカーとして、慢性肝疾患患者の血中のフコシル化ハプトグロビンとフコシル化標的蛋白であるMac-2bpを測定した。肝細胞癌の腫瘍マーカーとしてのフコシル化ハプトグロビンの有用性と、線維化マーカーとしてのMac-2bpの有用性が示唆された。
NS3/4Aと結合する宿主蛋白であるGPx8を同定した。その他にも多数の結合候補蛋白も検出された。
結論
３年計画の初年度において、キメラマスの作出、HCV感染モデルの作成など所期の計画を達成した。
公開日・更新日
公開日
2017-01-20
更新日
-