下痢症ウイルスの分子疫学と感染制御に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201447004A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 下痢症ウイルスの分子疫学と感染制御に関する研究
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 片山 和彦(国立感染症研究所 ウイルス第二部)

研究分担者(所属機関)

• 染谷　雄一(国立感染症研究所　ウイルス第二部 )
• 下池　貴志(国立感染症研究所　ウイルス第二部 )
• 藤井　克樹(国立感染症研究所　ウイルス第二部 )
• 朴　英斌　（パク　ヨンビン）(国立感染症研究所　ウイルス第二部 )
• 芳賀　慧(国立感染症研究所　ウイルス第二部 )
• 横山　勝(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析センター)
• 高木　弘隆(国立感染症研究所　バイオセーフティ管理室)
• 木村　博一(国立感染症研究所　感染症疫学センター)
• 四宮　博人(愛媛県立衛生環境研究所)
• 中込　治(長崎大学大学院・医歯薬学総合研究科)
• 谷口　孝喜(藤田保健衛生大学)
• 津川　毅(札幌医科大学小児科)
• 中西　章(国立長寿医療研究センター研究所)
• 本村　和嗣(大阪大学　微生物病研究所　日本-タイ新興再興感染症共同研究センター)
• 片山　浩之(東京大学大学院工学系研究科)
• 村田　和義(自然科学研究機構　生理学研究所)
• 水谷　哲也(東京農工大学　農学部附属国際家畜感染症防疫研究教育センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【委託費】 新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究
• 研究開始年度: 平成26(2014)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 22,940,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ノロウイルス（NoV）、サポウイルス（SaV）による流行性胃腸炎、冬期集団食中毒は、毎年世界的規模で発生し、ヒト社会活動や経済活動に大きなダメージを与えている。一方、ロタウイルス（RV）は、乳幼児を中心に重症ウイルス性下痢症を引き起こし、死亡例も多いことから問題となってきた。NoV, SaV, RVは、いずれも遺伝子型が多いことに加え、遺伝子変異、相互組換えが頻発し、毎年宿主免疫応答を回避する株が出現して、流行を繰り返す。本研究では、分子疫学研究による下痢症ウイルスの流行予測プログラム構築と、ワクチン、抗ウイルス薬、消毒薬開発を行う分子生物学的基礎研究が両輪となり、ウイルスの総合的な感染制御を目指す。

研究方法

分子疫学研究：
感染研・地研の情報ネットワークを用いた感染患者のNoV, SaV, RV網羅的なウイルスの全遺伝子配列を、次世代シーケンサー（NGS）で解析した。不顕性感染者を含むヒト集団での流行株を捉えるため、河川水、海水を定期的にサンプリングし、そこに含まれるNoV, SaV, RVの遺伝子配列もNGSで網羅的に検出した。JGRIDより2000年以降今年度までに採取され、保管された下痢症ウイルス患者検体の収集と、それらからの塩基配列データ取得も開始した。
基礎ウイルス学的研究：
疫学情報から読み取ったウイルスの抗原性変化を、VLPを用いて解析した。病原性変化の検証は、リバースジェネティックスシステム(RGS)などの生化学的研究手法を用いて調べた。他に、X線結晶構造解析、クライオ電子顕微鏡による構造解析を行い、塩基配列変化がウイルス粒子やタンパク質にどのような影響を及ぼすのかを調べた。

結果と考察

分子疫学研究：
NGSを用い、NoVまたは、SaV陽性便検体約240検体、RV陽性便検体約120検体、原因不明の下痢症患者検体48検体のシーケンスが終了した。解析の結果、NoV GIは、ブタNoVGIIから、約4000年前、ウシNoVGIIIから3000年前に分岐し、その後、約830年間を経て、約10-3 substitutions/site/yearで進化してきたことが示唆された。キャプシド蛋白は中和抗体宿主からの生体防御の圧力を受けにくく、かつ中和抗体が誘導されにくい性質を有すると考えられた。JGRIDプロジェクトの一環として実施したタイの下水中のNoV調査から、GII.4以外の遺伝子型は病原性が低く、大部分が不顕性である可能性が高いことが示唆された。RVでは、重症入院症例から分離される株の調査を行った結果、ワクチン導入後、RV胃腸炎の入院症例が激減したことが明らかになった。2012/13年の主要流行株DS-1-like G1は検出されなかった。RVワクチン株と家畜RV株間でのリアソータントは検出されなかった。
基礎ウイルス学的研究：
HuNoV, MNVのRGSを構築し遺伝子改変新生感染性ウイルスの産生が可能となった。NoV GI 9種類、GII 19種類のVLPを作製した。弱毒化ウイルスの作製、ウイルス複製阻害剤の研究、ワクチン開発への応用が可能となった。MNV-S7株VLPから20Å分解能の三次元構造を得た。サポウイルスVLPの8Å分解能の分子モデルを構築した。RV感染細胞のトモグラムから、RVの内部構造観察に成功した。HuNoV、 MNVのRdRpの結晶構造解析に成功した。NoV RdRpの分子動力学シミュレーションを行い、RdRpの平衡構造を得た。さらに、核酸類似体のin silicoスクリーニングに必要である活性中心の構造を明らかにした。
HuNoVの代替えウイルスとして、MNVを用い、細胞継代に伴って発生する遺伝子割合変化を次世代シーケンスで解析した。Feline calicivirus(FCV)とMNVを用いて新規エタノール製剤などの不活性化効果を検討した。
RVのセグメント11のRGS構築を試みた。さらに、プラスミドベースRGSの開発も開始した。

結論

分子疫学研究は、さらなるデータ蓄積を行う。NoV RGSの完成は、疫学研究、分子生物学研究から導かれる核酸やアミノ酸の変異の意義づけ、ウイルス複製に関する薬剤の効果を、実際にウイルス遺伝子を操作しながら試験管内で調べることを可能とした。NoV RdRpの構造解析、NoV VLPと感染性粒子の形状比較、病原性発現機構の解析がスタートした、疫学情報の充実と共に、核酸の経時的変遷が、粒子構造、酵素活性にどのように影響を与えているのかを実証しつつ研究を進める。RVについては、RGSの応用と改変、構造解析が進み、RVのゲノムRNAが内殻にぶら下がっている可能性が示唆された。また、ゲノムセグメントをパッケージするメカニズムの研究を行うことが可能となった。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-01
• 更新日: 2015-06-03

行政効果報告

• 文献番号: 201447004C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: NoV RGSの完成は、疫学研究、分子生物学研究から導かれる核酸やアミノ酸の変異の意義づけ、ウイルス複製に関する薬剤の効果を、実際にウイルス遺伝子を操作しながら試験管内で調べることを可能とした。疫学情報の充実と共に、核酸の経時的変遷が、粒子構造、酵素活性にどのように影響を与えているのかを実証できるようになった。RVについては、RGSの応用と改変、構造解析が進み、RVのゲノムRNAが内殻にぶら下がっている可能性が示唆された。現在、ゲノムセグメントをパッケージするメカニズムの研究を進めている。
• 臨床的観点からの成果: RVでは、重症入院症例から分離される株の調査を行った結果、ワクチン導入後、RV胃腸炎の入院症例が激減したことが明らかになった。
• ガイドライン等の開発: IASRにて、ノロウイルスの新規遺伝子型決定方法を示し、遺伝子型分類法を世界標準を作製して、Archives of Virologyに発表した。
• その他行政的観点からの成果: 特になし
• その他のインパクト: 平成26年7月12日 日本ウイルス学会北海道支部 第48回夏季シンポジウム“ウイルス研究の基礎から応用への橋渡し”（北海道上川郡美瑛町白金温泉 国立大説青少年交流の家） 特別講演 ノロウイルス研究のトピックス平成26年11月9日 ウイルス学会サテライトセミナー 横浜市民講座 “ノロウイルス” 日本ウイルス学会・神奈川県横浜市。平成26年11月15日 “知っているようで知らないノロウイルス” 健康公開講座 NHK横浜放送局共催横浜市民講座・神奈川県横浜市などの講演を行った。

発表件数

• 原著論文（和文）: 3件
• 原著論文（英文等）: 9件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 28件
• 学会発表(国際学会等): 12件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kinoshita S, Noguchi A, Miura S, Nakagomi T, et al.; A retrospective, hospital-based study to determine the incidence of rotavirus hospitalizations among children less than 5 years of age over a 10-year period (2001-2011) in Akita prefecture, Japan.; Jpn J Infect Dis , 67 (6) , 464-468 (2014)
• 原著論文2: Fujii Y, Nakagomi T, Nishimura N, Noguchi A, et al.; Spread and predominance in Japan of novel G1P[8] double-reassortant rotavirus strains possessing a DS-1-like genotype constellation typical of G2P[4] strains; Infect Genet Evol , 28 , 426-433 (2014)
• 原著論文3: Komoto S, Pongsuwanna Y, Ide T, Wakuda M, et al.; Whole genomic analysis of porcine G10P[5] rotavirus strain P343 provides evidence for bovine-to-porcine interspecies transmission. ; Vet Microbiol , 174 , 577-583 (2014)
• 原著論文4: Komoto S, Wandera Apondi E, Shah M, et al.; Whole genomic analysis of human G12P[6] and G12P[8] rotavirus strains that have emerged in Kenya: identification of porcine-like NSP4 genes.; Infect Genet Evol , 27 , 277-293 (2014)
• 原著論文5: Masuda T, Nagai M, Yamasato H, Tsuchiaka S, et al.; Identification of novel bovine group A rotavirus G15P[14] strain from epizootic diarrhea of adult cows by de novo sequencing using a next-generation sequencer.; Vet Microbiol , 171 , 66 -73 (2014)
• 原著論文6: 津川毅; ロタウイルスワクチンと腸重積症; 感染症内科 (2014)
• 原著論文7: 津川毅; ロタウイルスワクチン～開発の歴史、現状と今後の課題～; 小児科臨床 (2014)
• 原著論文8: 津川毅; ロタウイルスワクチンの接種について; Vaccine Digest (2014)
• 原著論文9: Katayama K, Murakami K, Sharp TM, Guix S, et al.; Plasmid-based human norovirus reverse genetics system produces reporter-tagged progeny virus containing infectious genomic RNA; PNAS (2014)
• 原著論文10: Endo Y., Noguchi S., Hara Y., Hayashi Y., et al.; Dominant mutations in ORAI1 cause tubular aggregate myopathy with hypocalcemia by constitutive activation of store-operated Ca2+ channel; Hum Mol Genet. (2014)
• 原著論文11: Makoto Nagai, Saya Shimada, Yoshiki Fujii, Hiromitsu Moriyama, et al.; H2 genotypes of G4P[6], G5P[7], and G9[23] porcine rotaviruses show super-short RNA electropherotypes; Veterinary Microbiology (2014)
• 原著論文12: Manabu Nemoto, Makoto Nagai, Hiroshi Tsunemitsu, Tsutomu Omatsu, et al.; Whole genome sequence analysis of G3 and G14 equine group A rotaviruses isolated in the late 1990s; Archives of Virology (2014)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-07-13
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201447004Z