文献情報
文献番号
201443003A
報告書区分
総括
研究課題名
慢性疼痛に対する画期的核酸医薬の開発
課題番号
-
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
横田 隆徳(東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科)
研究分担者(所属機関)
- 大川 淳(東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究科 )
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【委託費】 慢性の痛み解明研究
研究開始年度
平成26(2014)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
8,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
国民病である腰部脊柱管狭窄症にともなう腰痛や下肢痛、難治性がん性疼痛は大きな苦痛とADLの低下をきたす社会問題となっており、難治例にも特効するバイオ医薬が望まれる。我々の開発した新規のデリバリー内蔵型核酸医薬を用いて後根神経節（以下DRG）を標的に慢性疼痛に対する効果的な治療法を目的とした基盤技術の開発を行うことが目標である。
研究方法
平成26年度は、DRGの内因性遺伝子の制御を目的とし、核酸修飾を行い遺伝子抑制の最適化を検討した。また、上肢および下肢のアロディニアモデルマウスを作製して治療有効性評価のためにも知覚過敏の状況を検証した。
1) ncRNAである内因性遺伝子malat1の発現抑制効果：7週齢マウスを用いて静脈内投与によりmalat1遺伝子に対する高濃度ヘテロ核酸(Toc-HDO)を投与した。対照としてPBS投与群およびmalat1に対するASO投与群を設定した。投与後72時間でDRGおよび腰髄を採取し、qRT-PCRによりmalat1遺伝子の発現を検討した。Housekeeping geneとしてはGAPDHを使用した。また解剖時に採血も行い、肝・腎毒性も併せて検討した。
2) DRGに対するデリバリーリガンド分子の最適化：DRGに特異的なDRGペプチド（SPGARAF）が報告されている（Terashima et al. J Clin Invest. 2009）。本研究では、HDOに同ペプチドを修飾させる方法を計画した。分子薬理学的手法でヘテロ核酸の5’側にDRGペプチドを結合させたDRGペプチド‐HDO複合体を作製した。さらに3’側に蛍光タンパクAlexa647を修飾した。正常マウスに同複合体を経静脈、クモ膜下投与を行ってDRG内でのDNA分布を蛍光タンパクの発現で比較・解析を行った。
3) 神経障害性疼痛モデルマウスの作製と評価
下肢アロディニアモデル：脛骨神経・腓骨神経を切断し、腓腹神経が残存させることで知覚過敏状態になるSpared Nerve Injury（SNI）モデルマウスを作製した。SNIモデル作製後、毎週、知覚評価として足底部の腓腹神経支配領域に機械刺激、冷刺激、熱刺激を与えた。
上肢アロディニアモデル：マウスを用いて麻酔下に頚椎椎弓を露出し、右第7頚部神経根を露出させた。血管クリップを用いて神経根を10秒圧迫して解除した。
1) ncRNAである内因性遺伝子malat1の発現抑制効果：7週齢マウスを用いて静脈内投与によりmalat1遺伝子に対する高濃度ヘテロ核酸(Toc-HDO)を投与した。対照としてPBS投与群およびmalat1に対するASO投与群を設定した。投与後72時間でDRGおよび腰髄を採取し、qRT-PCRによりmalat1遺伝子の発現を検討した。Housekeeping geneとしてはGAPDHを使用した。また解剖時に採血も行い、肝・腎毒性も併せて検討した。
2) DRGに対するデリバリーリガンド分子の最適化：DRGに特異的なDRGペプチド（SPGARAF）が報告されている（Terashima et al. J Clin Invest. 2009）。本研究では、HDOに同ペプチドを修飾させる方法を計画した。分子薬理学的手法でヘテロ核酸の5’側にDRGペプチドを結合させたDRGペプチド‐HDO複合体を作製した。さらに3’側に蛍光タンパクAlexa647を修飾した。正常マウスに同複合体を経静脈、クモ膜下投与を行ってDRG内でのDNA分布を蛍光タンパクの発現で比較・解析を行った。
3) 神経障害性疼痛モデルマウスの作製と評価
下肢アロディニアモデル：脛骨神経・腓骨神経を切断し、腓腹神経が残存させることで知覚過敏状態になるSpared Nerve Injury（SNI）モデルマウスを作製した。SNIモデル作製後、毎週、知覚評価として足底部の腓腹神経支配領域に機械刺激、冷刺激、熱刺激を与えた。
上肢アロディニアモデル：マウスを用いて麻酔下に頚椎椎弓を露出し、右第7頚部神経根を露出させた。血管クリップを用いて神経根を10秒圧迫して解除した。
結果と考察
1) 内因性遺伝子malat1の発現抑制効果：malat1を高濃度で静脈内投与した場合、DRGでは70%前後の抑制効果が認められた。一方、腰部脊髄では50％前後の抑制効果が確認された。両者ともASOに比較して、明らかに有効で肝障害も全く認めなかった。よって、HDOでDRGおよび腰部脊髄で充分な遺伝子抑制効果が認められた。この効果はいずれも、一本鎖ASOよりも有効であった。複数回投与を行うことにより、より有効な効果が得られると考える。また副作用を全く認めなかったことより、核酸の配列により副作用を軽減させる可能性が示唆された。
2) デリバリーリガンド分子の最適化：投与翌日にL5DRGの凍結切片を作製し、Alexa647の局在を観察した。静脈投与において、対照群ではDRG細胞周囲のsatellite cellにAlexa647が集積していた。DRGペプチド群では、DRG細胞内へのAlexa647がdot-like-signalとして観察できたが発現は弱かった。クモ膜下腔投与では、DRGペプチド群で核内のAlexa647発現が強く観察された。DRGは血管が豊富でblood-nerve barrierが脆弱なためHDOによる導入が可能性であった。しかし、静脈投与での発現が低くDRG内での高発現効果を得るためにも核酸構造、核酸修飾の変更についてもさらなる検討が必要であった。
3) 神経障害性疼痛モデルマウスの作製と評価：SNIモデル作製後、足趾は知覚過敏状態となり1週間後から機械刺激とアセトンによる冷刺激で対照群と有意差を生じた。熱刺激には、2週目以降で過敏となった。上肢アロディニアモデルに関して、頚部神経根圧迫後、一時的に前肢の麻痺が出現したが徐々に改善した。その後、機械刺激、冷刺激に過敏になった。ただし、手術操作が煩雑で習熟を要し、再現性の確認が必要であった。
2) デリバリーリガンド分子の最適化：投与翌日にL5DRGの凍結切片を作製し、Alexa647の局在を観察した。静脈投与において、対照群ではDRG細胞周囲のsatellite cellにAlexa647が集積していた。DRGペプチド群では、DRG細胞内へのAlexa647がdot-like-signalとして観察できたが発現は弱かった。クモ膜下腔投与では、DRGペプチド群で核内のAlexa647発現が強く観察された。DRGは血管が豊富でblood-nerve barrierが脆弱なためHDOによる導入が可能性であった。しかし、静脈投与での発現が低くDRG内での高発現効果を得るためにも核酸構造、核酸修飾の変更についてもさらなる検討が必要であった。
3) 神経障害性疼痛モデルマウスの作製と評価：SNIモデル作製後、足趾は知覚過敏状態となり1週間後から機械刺激とアセトンによる冷刺激で対照群と有意差を生じた。熱刺激には、2週目以降で過敏となった。上肢アロディニアモデルに関して、頚部神経根圧迫後、一時的に前肢の麻痺が出現したが徐々に改善した。その後、機械刺激、冷刺激に過敏になった。ただし、手術操作が煩雑で習熟を要し、再現性の確認が必要であった。
結論
ヘテロ核酸投与によりncRNAであるmalat1遺伝子においてもDRG及び脊髄で充分な遺伝子抑制効果が観察された。DRGペプチド‐HDO複合体は静脈投与でDRGへの集積が確認できたが、クモ膜下腔投与と比較すると集積は低く、さらなる最適化が必要であった。SNIモデルが、下肢アロディニアを有した再現性の高い神経障害性疼痛モデルであった。上肢アロディニアモデルの作製に関しては手技的に改善が必要であった。
公開日・更新日
公開日
2015-06-26
更新日
-