細胞・組織加工製品の開発環境整備に向けたレギュラトリーサイエンス研究

文献情報

• 文献番号: 201427030A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 細胞・組織加工製品の開発環境整備に向けたレギュラトリーサイエンス研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-医薬-指定-027
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 佐藤 陽治(国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子細胞医薬部)

研究分担者(所属機関)

• 堤　秀樹(公益財団法人実験動物中央研究所)
• 澤田　留美(国立医薬品食品衛生研究所)
• 鈴木　孝昌(国立医薬品食品衛生研究所)
• 安田　智(国立医薬品食品衛生研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 31,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は，新たなガイドライン作成に資する細胞・組織加工製品，特に幹細胞加工製品の品質・安全性評価法の開発を行うことを目的とする．

研究方法

①幹細胞製品の造腫瘍性試験法の開発，②細胞のがん化指標の設定，③-1次世代シークエンサーを用いた細胞の遺伝的安定性評価指標の開発，③-2遺伝的安定性評価ツールとしての次世代シークエンサーの性能評価と遺伝的安定性評価リファレンスとしての日本人ゲノムのde novo配列決定，④分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析法の開発，に関する研究を実施した．

結果と考察

①我々は Rag2遺伝子とIL-2Rγ遺伝子をダブルノックアウトし，BALB/c系に遺伝子置換した免疫不全マウス（BRGマウス）を開発・維持しており，さらにヌード化あるいはヘアレス化した系統（BRG-nuマウス，BRG-hrマウス）も作出している．新たな造腫瘍性試験用動物としての適性を判断するために，これらの系統のHeLa細胞を用いてのTPD50によるヒト細胞生着能評価を行った．BRG-nuマウスが造腫瘍性試験用動物として NOGマウスや BRGマウスよりも優位であった．異種細胞生着感度の点からヌード化（nu遺伝子導入）した系統が優位であることが考えられた．②ヒト間葉系幹細胞（hMSCs）において，レトロトランスポゾンLINE-1sの発現とさらにその抑制因子と報告されているAPOBEC3B （A3B）の遺伝子型との関連や，さらに幹細胞の未分化性とLINE-1sの発現との関連についても検討を行った．次世代シーケンサーを用いてA3B野生型ホモとA3B欠失型ホモの RNA配列を網羅的に解析し比較したところ，両者で転移活性の残ったLINE-1sの発現量には大きな違いが見られなかった．日本人に多いとされるA3B欠失によりhMSCにおけるLINE-1sの転移によるゲノムの安定性を損なう危険性は示されなかった．また，hMSCを脂肪へ分化させることにより，LINE-1s mRNAの発現量が低下した．LINE-1sの発現がhMSCsの分化能を示すマーカーの一つとなり得る可能性が示唆された．③-1次世代シークエンサーによって，未知のゲノムリアレンジメントにおける遺伝子増幅は比較的詳細に検出可能であった．しかし染色体転座などの切断点の同定には，通常のアラインメント解析結果の利用は難しく，特にゲノム上に顕在する単純なリピート配列が解析を困難とした．また，遺伝的不安定性のモデルとしてBLMを破壊した細胞を用い，次世代シークエンサーによる変異の検出に関する検討を開始した結果，通常のホールゲノム解析においては，顕著な変化は検出されなかった．③-2品質管理や医療診断などに次世代シーケンサーを用いる場合には，各種解析ごとにエラー率を考慮する必要があり，そのエラー頻度を正確に予測する技術が要求される．そこで，標準ゲノムDNAの読み間違いエラー率を各変異箇所において検証し，それら解析結果についてのバラツキの程度をCV値（変動係数）によって評価した．シーケンスの精度を高めるためには，カバレッジを深くすることの他に，独立した複数の解析を実施することも重要であることが示唆された．一方，それぞれの人種は，さまざまな多型を保持していること知られ，既存のリファレンス配列とは大きく異なる構造多型等を検出するためには，リファレンス配列に頼ることなく，de novoアセンブリを行う必要がある．日本人を対象とした再生医療を念頭に，第一段階として一人の健常日本人男性を選び，既存のリファレンス配列を用いずに全ゲノム配列決定を行った．日本人を対象とした医療を考える場合，治療のための細胞品質評価も含め，de novoアセンブリと第3世代シークエンサーを利用し，日本人ゲノムのリファレンス配列を用意することが有効であると考えられ，本研究においてその最初のデータを産出することができた．④遺伝子ネットワーク・パスウェイ解析により絞り込んだ分化プロペンシティと発現量との相関のあるmiRNAのヒトiPS細胞安定発現株を樹立し，神経細胞／心筋細胞の分化実験および胚葉体形成に供し，分化効率を比較し，これらmiRNAがヒトiPS細胞の分化において機能的な役割を果たしているのかを確認した．今回報告した手法を利用することにより，最終製品に適したヒトiPS細胞株の選択が可能になると思われる．

結論

本研究の成果により，細胞・組織加工製品の有効性・安全性に関する品質評価に必要な指標・評価法が示され，迅速で適切な製品開発・審査および再生医療の実用化推進に貢献できると考えられる．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201427030B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 細胞・組織加工製品の開発環境整備に向けたレギュラトリーサイエンス研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-医薬-指定-027
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 佐藤 陽治(国立医薬品食品衛生研究所 遺伝子細胞医薬部)

研究分担者(所属機関)

• 堤　秀樹(公益財団法人実験動物中央研究所)
• 澤田　留美(国立医薬品食品衛生研究所)
• 鈴木　孝昌(国立医薬品食品衛生研究所)
• 安田　智(国立医薬品食品衛生研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 【補助金】 医薬品・医療機器等レギュラトリーサイエンス総合研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は，新たなガイドライン作成に資する細胞・組織加工製品，特に幹細胞加工製品の品質・安全性評価法の開発を行うことを目的とする．幹細胞の加工過程における未分化細胞／異常細胞の混入は，幹組織加工製品においてがん化を引き起こすとして最も懸念される．汎用性・定量性のある幹細胞加工製品の造腫瘍性試験法の開発を目指した実験研究を展開する．また細胞の培養・加工過程での細胞の形質安定性も考慮に入れる必要があることから，培養工程での遺伝子発現の動態解析による品質評価法および遺伝子安定性評価法の開発に関する研究を行う．さらに安全性上の懸念として，ヒト多能性幹細胞株間での各種目的細胞への分化プロペンシティのバラツキがあり，その情報は原材料である細胞株の選択に必要不可欠である．未分化細胞において分化プロペンシティの評価系を含んだ細胞特性解析を実施する．

研究方法

①幹細胞製品の造腫瘍性試験法の開発，②細胞のがん化指標の設定，③-1次世代シークエンサーを用いた細胞の遺伝的安定性評価指標の開発，③-2遺伝的安定性評価ツールとしての次世代シークエンサーの性能評価と遺伝的安定性評価リファレンスとしての日本人ゲノムのde novo配列決定，④分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析法の開発，に関する研究を実施した．

結果と考察

①NOG-hrマウス，BRGマウス，BRG-nuマウス，BRG-hrマウスの表現型解析を行い，新たな造腫瘍性試験用動物としての適性を判断した．BRG-nuマウスが，造腫瘍性試験用動物として NOGマウスや BRGマウスよりも優位であった．ヘアレス遺伝子が導入された 2系統（NOG-hrおよびBRG-hr）は異種細胞生着能が低下していた．②Cyclin D2は細胞増殖やがん化等に関わる遺伝子群の発現に影響を及ぼす事によって間葉系幹細胞（hMSC）の増殖亢進に寄与する事が示唆された．hMSCにおいてgenome integrityを脅かす可能性があるLINE-1sについてその発現と転移について検討したところ，日本人に多いとされるA3Bの欠失によりLINE-1sの転移によるゲノムの安定性を損なう危険性は示されなかった．また，LINE-1sの発現はhMSCsの分化能を示すマーカーの一つになり得る可能性が示された．③-1ホールゲノム解析を行った結果，SNPの検出を含めて，シークエンス解析法としての有用性を確認するとともに，コピー数変化の検出法としても有用であることがわかった．またミトコンドリアでの一分子シークエンサーによる変異解析の有効性を検証した結果，用いたシークエンサーのエラー率の高さから期待した感度は得られなかった．③-2品質管理や医療診断などに次世代シーケンサーを用いる場合には，各種解析ごとにエラー率を考慮する必要があり，そのエラー頻度を正確に予測する技術が要求される．そこで，標準ゲノムDNAの読み間違いエラー率を各変異箇所において検証し，それら解析結果についてのバラツキの程度を変動係数によって評価した．シーケンスの精度を高めるためには，カバレッジを深くすることの他に，独立した複数の解析を実施することも重要であることが示唆された．一方，それぞれの人種は，さまざまな多型を保持していること知られ，既存のリファレンス配列とは大きく異なる構造多型等を検出するためには，リファレンス配列に頼ることなく，de novoアセンブリを行う必要がある．第一段階として一人の健常日本人男性を選び，既存のリファレンス配列を用いずに全ゲノム配列決定を行った．日本人を対象とした医療を考える場合，治療のための細胞品質評価も含め，日本人ゲノムのリファレンス配列を用意することが有効であると考えられる．④ヒトiPS細胞株から胚葉体を形成させ，三胚葉マーカー遺伝子を定量し，主成分分析を行うことにより，各々の細胞株の三胚葉系への分化プロペンシティを数値化した．さらに未分化状態でのiPS細胞株の網羅的なトランスクリプトーム解析を行い，発現量と分化プロペンシティとの相関のあるmRNAとmiRNAの同定を行った．この分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析の手法は，最終製品に適切なiPS細胞株の評価に役立つことが期待される．

結論

本研究の成果により，細胞・組織加工製品の有効性・安全性に関する品質評価に必要な指標・評価法が示され，製品の迅速かつ経済的な開発の推進および効率的審査が可能になることにより，特に治療困難な重篤な疾患に対して期待の大きい再生医療が実用化され普及することに貢献できる．国民に安全かつ有用性に高い再生医療をいち早く提供するという厚生労働行政の施策に大きく寄与するものと考えられる．

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201427030C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 新たなガイドライン作成に資する幹細胞加工製品の品質・安全性評価法の開発を目的とし，①幹細胞製品の造腫瘍性試験法の開発，②細胞のがん化指標の設定，③-1次世代シークエンサーを用いた細胞の遺伝的安定性評価指標の開発，③-2遺伝的安定性評価ツールとしての次世代シークエンサーの性能評価と遺伝的安定性評価リファレンスとしての日本人全ゲノムのde novo配列決定，④分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析法の開発，に関する研究を実施し，有効性・安全性に関する品質評価に必要な指標・評価法を示した．
• 臨床的観点からの成果: 幹細胞加工製品などの再生医療等製品は，生細胞を含むという従来の医薬にはない特性を持ち，その品質・安全性確保にも新しい視点が必要とされる．本研究で開発・性能評価された試験法・細胞特性指標，及び既存の白人由来参照配列に依らずに決定された日本人全ゲノム配列情報は，わが国発の再生医療等製品の特性に則した，適切な品質・安全性評価に活用することができる．また，日本人全ゲノム配列情報は，再生医療等製品の品質評価のみならず，わが国の様々な医療・医学研究・医薬品開発においても幅広く活用可能な重要な基盤となる．
• ガイドライン等の開発: 本研究を通じて導き出された考え方，特に原料としての多能性幹細胞の品質評価における，分化プロペンシティを指標とした細胞特性解析法の意義については，次世代医療機器評価指標再生医療分野審査WG（ヒト同種iPS細胞由来網膜色素上皮細胞）における話題提供「ヒト多能性幹細胞由来再生医療製品の原料・材料に関する留意点について」（平成25年11月22日）の中で発表され，その内容は「同種iPS（様）細胞由来網膜色素上皮細胞に関する評価指標」（薬食機参発0912第2号別添1平成26年9月12日）に反映されている．
• その他行政的観点からの成果: 本研究を通じて導き出された再生医療等製品の品質・安全性，特に造腫瘍性や遺伝的安定性の評価に関する考え方については，平成24-25年度のPMDA科学委員会細胞組織加工製品専門部会での発表や議論のなかで本研究代表者により披露され，その内容は，同専門部会の報告書「iPS細胞等をもとに製造される細胞組織加工製品の造腫瘍性に関する議論のまとめ」(平成25年8月20日) にも盛り込まれた．
• その他のインパクト: 本研究の成果の一部は，国際生物薬品標準化連盟（IABS）と科学技術振興機構（JST）との国際合同ワークショップ（平成26年3月7-8日，京都）およびIABS，医薬品医療機器総合機構（PMDA），JST，医薬基盤研究所（NIBIO）の国際合同ワークショップ（平成27年2月18-19日，東京）でも発表されており，海外の研究者・規制当局者等にも影響を与えている．

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 20件
• その他論文(和文): 29件
• その他論文(英文等): 3件
• 学会発表(国内学会): 51件
• 学会発表(国際学会等): 30件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 1件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 悪性形質転換の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2014-176861 ; 発明者名: 草川森士, 安田 智, 佐藤陽治 ; 権利者名: 草川森士, 安田 智, 佐藤陽治 ; 出願年月日: 20140901 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kono K, Takada N, Sato Y. et al.; Characterization of the cell growth analysis for detection of immortal cellular impurities in human mesenchymal stem cells. ; Biologicals , 43 , 146-149 (2015)
• 原著論文2: Kusakawa S, Machida K, Sato Y. et al.; Characterization of in vivo tumorigenicity tests using severe immunodeficient NOD/Shi-scid IL2Rgamma null mice for detection of tumorigenic cellular impurities in human cell-processed therapeutic products.; Regenerative Therapy , 1 , 30-37 (2015)
• 原著論文3: Tano K, Yasuda S, Sato Y. et al.; A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system.; PLoS One , 9 (2014)
• 原著論文4: Kuroda T, Yasuda S, Sato Y. ; Tumorigenicity studies for human pluripotent stem cell–derived products.; Biol. Pharm. Bull , 36 (2) , 189-192 (2013)
• 原著論文5: Kuroda T, Yasuda S, Sato Y. et al.; Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. ; PLoS One , 7 (5) (2012)
• 原著論文6: Kanemura H, Go MJ, Kawamata S. et al.; Pigment epithelium-derived factor secreted from retinal pigment epithelium facilitates apoptotic cell death of iPSC. ; Sci Rep. , 3 (2013)
• 原著論文7: Nakaya M, Tajima M, Kurose H. et al.; GRK6 deficiency in mice causes autoimmune disease due to impaired apoptotic cell clearance. ; Nat Commun , 4 (2013)
• 原著論文8: Nakaya M, Chikura S, Kurose H. et al.; Induction of cardiac fibrosis by β-blocker in G protein-independent and GRK5/β-arrestin2-dependent signaling pathways.; J Biol Chem. , 287 (42) , 35669-35677 (2012)
• 原著論文9: Sasaki H., Takeuchi I., Kato R. et al.; Label-free morphology-based prediction of multiple differentiation potentials of human mesenchymal stem cells for early evaluation of intact cells.; PLOS ONE , 9 (4) (2014)
• 原著論文10: Kono K., Niimi S., and Sawada R.; Cyclin D2 promotes the proliferation of human mesenchymal stem cells.; J. Bone Marrow Res. , 2 (136) , 1000136- (2013)
• 原著論文11: Sawada R., Kono K., Matsuoka A. et al.; Calcium-incorporated titanium surfaces influence the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.; J. Biomed. Mater. Res. A. , 101 (9) , 2573-2585 (2013)
• 原著論文12: Ito-Nagahata T., Kurihara C., Fujiwara Y. et al.; Stilbene Analogs of Resveratrol Improve Insulin Resistance through Activation of AMPK.; Biosci. Biotechnol. Biochem. , 77 (6) , 1229-1235 (2013)
• 原著論文13: Fukuda A, Tomikawa J, Umezawa A. et al.; The role of maternal-specific H3K9me3 modification in establishing imprinted X-chromosome inactivation and embryogenesis in mice.; Nat Commun , 5 , 5464- (2014)
• 原著論文14: Izumi Y, Suzuki E, Fukami M. et al.; Genome-wide copy number analysis and systematic mutation screening in 58 patients with hypogonadotropic hypogonadism.; Fertil Steril , 102 (4) , 1130-1136 (2014)
• 原著論文15: Migita O, Maehara K, Hata K. et al.; Compilation of copy number variants identified in phenotypically normal and parous Japanese women.; J Hum Genet , 59 (6) , 326-331 (2014)
• 原著論文16: Nishikawa K, Iwaya K, Sakamoto T. et al.; Resveratrol increases CD68+ Kupffer cells co-localized with adipose differentiation- related protein (ADFP) and ameliorates high-fat-diet-induced fatty liver in mice.; Mol Nutr Food Res. (2015)
• 原著論文17: Suzuki T.; Unconscious Exposure to Radiation.; Genes and Environment , 35 , 63-68 (2013)
• 原著論文18: Suzuki T.; “Scientific Considerations Regarding Radiation Risk” JEMS Open Symposium 2012.; Genes and Environment , 35 , 57-62 (2013)
• 原著論文19: Suenaga K, Takasawa H, Furihata C. et al.; Differential gene expression profiling between genotoxic and non-genotoxic hepatocarcinogens in young rat liver determined by quantitative real-time PCR and principal component analysis.; Mutat Res. , 751 , 73-83 (2013)
• 原著論文20: Watanabe T, Suzuki T, Furihata C. et al.; Discrimination of genotoxic and non-genotoxic hepatocarcinogens by statistical analysis based on gene expression profiling in the mouse liver as determined by quantitative real-time PCR. ; Mutat Res. , 747 , 164-175 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-29
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201427030Z