重症の腸管出血性大腸菌感染症の病原性因子及び診療の標準化に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201420021A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 重症の腸管出血性大腸菌感染症の病原性因子及び診療の標準化に関する研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-新興-一般-012
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 大西 真(国立感染症研究所 細菌第一部)

研究分担者(所属機関)

• 井口　純(宮崎大学　農学部)
• 八尋　錦之助(千葉大学　医学部)
• 伊豫田　淳(国立感染症研究所　細菌第一部)
• 黒田　誠(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 林　哲也(宮崎大学フロンティア科学実験総合センター)
• 桑原　知己(香川大学　医学部)
• 綿引　正則(富山県衛生研究所)
• 勢戸　和子(大阪府公衆衛生研究所)
• 甲斐　明美(東京都健康安全研究センター　微生物部)
• 五十嵐　隆(国立成育医療研究センター)
• 齋藤　昭彦(新潟大学大学院　)
• 伊藤　秀一(国立成育医療研究センター)
• 幡谷　浩史(東京都立小児総合医療センター　腎臓内科)
• 水口　雅(東京大学　大学院医学系研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究費: 107,914,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では非典型的なEHEC感染症が発生した際に遅滞無く対応できる検査体制の整備ならびに重傷例における診療の標準化を行なうことを目的とした。国内分離株の情報整理、分離株の血清群の分布、病原因子プロファイル解析、非典型病原因子, subABの機能解析、非典型的な血清群の迅速な決定／推定法の検証、血清診断の検証、ゲノム情報の蓄積、動物モデルの構築、EHEC感染症における死亡例の臨床的解析を実施した。

研究方法

昨年度に引き続き、細菌学研究グループと臨床グループを組織し、各グループにおいて研究目的に沿って研究が実施された。腸管出血性大腸菌分離株に関して、血清群別、stx遺伝子型別、eae, saa, subA, aggR 遺伝子の有無を既存の方法で検討した。O抗原合成遺伝子群特異的PCR法の開発、ゲノム解析、患者血清中の抗大腸菌抗体価の測定、動物モデルの検討、SubAB毒素の機能解析について研究を実施した。加えて本研究におけるEHECゲノム情報の蓄積と併せて、感染症研究国際ネットワーク推進プログラムとの連携でコレラ菌のゲノム解析を実施した。コレラ菌O型別参照株210株のゲノム解析と併せて、岡山大学インド拠点、大阪大学タイ拠点、長崎大学ベトナム拠点、神戸大学インドネシア拠点と連携を深めるため、感染研よりゲノムDNA調整のプロトコールを提示し、各拠点による調整し感染研に送付したゲノムDNAをIllumina MiSeqあるいはHiSeqを用いてドラフトゲノム配列を取得した。感染研保存株EHEC O111においても同様にドラフトゲノム配列を取得した。

結果と考察

国内で分離される重症者由来の非典型的な腸管出血性大腸菌について、血清型別、毒素型別、病原因子の保有状況を明らかにした。その中で、国内で分離されるEHEC O26:H11/H-の多くはstx1のみを保有するが、近年stx2のみを保有する株が重症者からいくつか分離されていることが明らかとなった。ウシ糞便50検体の精査の結果、EHECが分離された検体は、合計41検体（82%）であった。少なくとも18検体で毒素型や性状の異なる複数のEHECが分離された。食品および環境材料から分離株の調査では、血清群はO74（豚ハツ由来），O119（牛ツラミ刺し由来），O142（豚タン由来），OUT（牛小腸由来）などの報告があった。腸管出血性大腸菌（EHEC）の感染が疑われる溶血性尿毒症症候群（HUS）患者などの血清について、重症患者からの分離が多いとされている7タイプのO抗原（O157、O26、O111、O103、O121、O145およびO165）に対する抗体価を測定され情報の蓄積が進んだ。Non-O157型の腸管出血性大腸菌が産生するSubAB の機能解析が進められた。大腸菌O血清群-PCR検査系（E. coli O-genotyping PCR法）を、野生株690株（O血清群が判定できた579株に加え、判定できなかった111株を含む）を用いて本法の妥当性および有効性を評価した。
　ゲノム解析においては、EHEC O111 集団事例株の配列およびnon-O157 EHEC（O121:H19, O145:HUT, O165:H-, O115:H10/H-）などの配列情報を収集した。富山県や福井県で集団食中毒を起こした菌株（Ty-1）を含むO111血清型を中心に、Stxの産生を誘導する生体内因子を検索した。感染部位に集積した好中球などの炎症細胞が産生する過酸化水素などの活性酸素種が、EHEC感染による大腸粘膜での炎症を誘導しStx2産生を促すことで組織傷害を増強する可能性が示唆するデータが得られた。デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)を用いたEHEC感染モデルから、大腸局所の炎症反応の強弱がStx2産生量に影響し、重症化への移行に重要な因子となると考えられた。
　Evidence Based Medicineに基づく溶血性尿毒症症候群(HUS)の診断・治療ガイドラインを2013年度に作成し、書籍として公表すると共に、英語版を作成し日本腎臓学会英文誌Clinical Experimental Nephrology誌に公表した。本ガイドラインはMindsのガイドライン作成基準に則った溶血性尿毒症症候群の診断・治療に関するわが国発のガイドラインで、Mindsのホームページにも公表された。

結論

　国内におけるEHEC感染症の情報が整理され、非典型的なEHEC感染症発生の際に如何に対応すべきか、その細菌学的知見を蓄積した。また、Mindsのガイドライン作成基準に則った溶血性尿毒症症候群(HUS)の診断・治療ガイドラインが完成した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-20
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201420021B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 重症の腸管出血性大腸菌感染症の病原性因子及び診療の標準化に関する研究
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H24-新興-一般-012
• 研究年度: 平成26(2014)年度
• 研究代表者(所属機関): 大西 真(国立感染症研究所 細菌第一部)

研究分担者(所属機関)

• 井口　純(宮崎大学　農学部)
• 八尋　錦之助(千葉大学　医学部)
• 伊豫田　淳(国立感染症研究所　細菌第一部)
• 黒田　誠(国立感染症研究所　病原体ゲノム解析研究センター)
• 林　哲也(宮崎大学フロンティア科学実験総合センター)
• 桑原　知己(香川大学　医学部)
• 綿引　正則(富山県衛生研究所)
• 勢戸　和子(大阪府公衆衛生研究所)
• 甲斐　明美(東京都健康安全研究センター　微生物部)
• 五十嵐　隆(国立成育医療研究センター)
• 齋藤　昭彦(新潟大学大学院　医学)
• 伊藤　秀一(国立成育医療研究センター)
• 幡谷　浩史(東京都立小児総合医療センター　腎臓内科)
• 水口　雅(東京大学　大学院医学系研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 新型インフルエンザ等新興・再興感染症研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成26(2014)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　腸管出血性大腸菌（enterohemorrhagic Escherichia coli: EHEC）による日本国内における感染者は無症状保菌者を含めて年間3,000名から4,000名を数える。国内ではHUS発症率は有症状者の４％程度であると考えられているが、時に多数のHUS症例および死亡者を含む集団事例が発生することがある。本研究では非典型的なEHEC感染症が発生した際に遅滞無く対応できる検査体制の整備ならびに重傷例における診療の標準化を行なうことを目的とした。

研究方法

細菌学研究グループと臨床グループを組織し、各グループにおいて研究目的に沿って研究が実施された。腸管出血性大腸菌分離株に関して、血清群別、stx遺伝子型別、eae, saa, subA, aggR 遺伝子の有無を既存の方法で検討した。O抗原合成遺伝子群特異的PCR法の開発、ゲノム解析、患者血清中の抗大腸菌抗体価の測定、動物モデルの検討、SubAB毒素の機能解析について研究を実施した。ガイドライン作成においては、EHECやHUSに造詣の深い臨床家・研究者と、臨床治験の専門家からなる14名からなる研究班を組織した。さらに、学識研究者や患者さんの代表4名に外部評価委員（査読委員）として参画戴いた。PubMedと医中誌をデータベースとして用い、1998年1月から2012年8月までに刊行された論文を、クリニカルクエスチョンに関連するキーワードを設定して検索した。エビデンスレベル（レベル1-6）を基準とし、ステートメントとその推奨レベル(グレードA-D)を作成した。推奨グレードは、エビデンスレベルだけでなく、国内における診療状況も鑑みて決定した。班員によって作成された本ガイドライン（案）を外部評価委員（査読委員）4名から評価を戴いた。その後、日本小児科学会、日本腎臓学会、日本小児腎臓病学会のホームページ上で公開し、各学会員からパブリックコメントを戴いた。これらのコメントをガイドライン作成班員で協議し、適切に対応し、ガイドラインに盛り込んだ。
　加えて本研究におけるEHECゲノム情報の蓄積と併せて、感染症研究国際ネットワーク推進プログラムとの連携でコレラ菌のゲノム解析を実施した。各拠点による調整されたゲノムDNAを感染研においてIllumina MiSeqあるいはHiSeqを用いてドラフトゲノム配列を取得した。

結果と考察

　国内臨床分離株の情報を整理し、血清群O157, O26, O111, O121, O103, O145, O165を７つの主要血清群として、特にこれらのEHECに関する検査体制を整える必要があることを示した。他の血清群における大規模集団事例の発生を想定して、血清群特異的なPCR法を開発し、HUS症例における血清診断による原因EHECの推定ならびに菌株分離の進め方を検討した。非定型な病原因子の多様性、分布を精査するとともに、SubAB毒素に関しては機能解析を進めた。2011年のユッケ関連集団事例EHEC O111株のゲノム学的解析、ファージの多様性解析を進めるとともに、多菌株のドラフトゲノム配列を取得した。EHEC O121, O145, O165, O115に加え、大腸菌の近縁種であり、EHECと共通の病原因子をもつE. arbertiiのゲノム解析を進めた。JGRIDとの連携で、コレラ菌のゲノム解析を開始し、国内外で問題となる下痢原性細菌(EHECおよびコレラ菌)のゲノムデータの集積を試み、計1610株のゲノム情報を取得した。
　エビデンスに基づき、Mindsのガイドライン作成基準を遵守したHUS診断･治療ガイドライン（日本語版、英語版）を作成した。日本語版は単行本（東京医学社）として刊行した。英語版は日本腎臓学会の機関誌である英文誌Clinical Experimental Nephrologyの2014年第4号に掲載した。
2) 同ガイドライン作成にあたっては、日本小児科学会、日本腎臓学会、日本小児腎臓病学会のホームページに案を提示し、パブリックコメントを募り、各学会員の御意見を反映した。
3) 作成した同ガイドラインは上記3学会の会委員向けホームページ（日本小児科学会、日本腎臓学会、日本小児腎臓病学会に掲載すると共に、Mindsのホームページにも掲載した。

結論

　国内におけるEHEC感染症の情報が整理され、非典型的なEHEC感染症発生の際に如何に対応すべきか、その細菌学的知見を蓄積した。また、Mindsのガイドライン作成基準に則った溶血性尿毒症症候群(HUS)の診断・治療ガイドラインが完成した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-20
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201420021C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: O抗原の多様性解析結果を利用し、血清群特異的なPCR法を開発した。非定型な病原因子の多様性・機能解析を進めた。2011年集団事例EHEC O111株のゲノム学的多様性解析を進めた。EHEC O121, O145, O165, O115に加え、EHECと共通の病原因子をもつE. arbertiiのゲノム解析を進めた。JGRIDとの連携で、コレラ菌のゲノム解析を開始し、国内外で問題となる下痢原性細菌(EHECおよびコレラ菌)のゲノムデータ計1610株のゲノム情報を取得した。
• 臨床的観点からの成果: Mindsのガイドライン作成基準を遵守したHUS診断･治療ガイドライン（日本語版、英語版）を作成した。; HUS症例における血清診断による原因EHECの推定ならびに菌株分離の進め方を検討した。菌株分離が困難で、原因診断に至らない症例において、治療の適正化に資する検査情報を提供しうることが示された。
• ガイドライン等の開発: エビデンスに基づき、Mindsのガイドライン作成基準を遵守したHUS診断･治療ガイドライン（日本語版、英語版）を作成した。日本語版は単行本（東京医学社）として刊行した。英語版は日本腎臓学会の機関誌である英文誌Clinical Experimental Nephrologyの2014年第4号に掲載した。作成した同ガイドラインは上記3学会の会委員向けホームページに掲載すると共に、Mindsのホームページにも掲載した。
• その他行政的観点からの成果: 国内臨床分離株の情報を整理し、血清群O157, O26, O111, O121, O103, O145, O165を７つの主要血清群として、特にこれらのEHECに関する検査体制を整える必要があることを示した。
• その他のインパクト: 特記なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 6件
• 原著論文（英文等）: 27件
• その他論文(和文): 39件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 114件
• 学会発表(国際学会等): 16件
• その他成果(特許の出願): 3件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: LAMP 法を用いた大腸菌 O 抗 原型の検査方法および検査試薬キット
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願 2012-091273 ; 発明者名: 井口純 ; 権利者名: 国立大学法人宮崎大学 ; 出願年月日: 20120412 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: PCR 法を用いた大腸菌の広 域 O 血清群判定方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願 2013-068464 ; 発明者名: 井口純 ; 権利者名: 国立大学法人宮崎大学 ; 出願年月日: 20130328 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: PCR 法を用いた大腸菌の広 域 O 血清群判定方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: PCT/JP2014/059097 ; 発明者名: 井口純 ; 権利者名: 国立大学法人宮崎大学 ; 出願年月日: 20140328 ; 国内外の別: 国外

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Iguchi A, Iyoda S, Kikuchi T,et al.; A complete view of the genetic diversity of the Escherichia coli O-antigen biosynthesis gene cluster.; DNA Research , 22 (1) , 101-107 (2015)
• 原著論文2: Watahiki,M., Isobe,J., Kimata,K.,et al.; Characterization of enterohemorrhagic Escherichia coli O111 and O157 strains isolated from outbreak patients in Japan; Journal of Clinical Microbiology , 52 (8) , 2757-2763 (2014)
• 原著論文3: Yahiro, K., H. Tsutsuki, K. Ogura,et al.; DAP1, a Negative Regulator of Autophagy, Controls SubAB-Mediated Apoptosis and Autophagy.; Infect Immun , 82 (11) , 4899-4908 (2014)
• 原著論文4: Nagasawa, S., K. Ogura, H. Tsutsuki,et al.; Uptake of Shiga-toxigenic Escherichia coli SubAB by HeLa cells requires an actin- and lipid raft-dependent pathway.; Cell Microbiol. , 16 (10) , 1582-1601 (2014)
• 原著論文5: Igarashi T, Ito S, Sako M,et al.; Guidelines for the management and investigation of hemolytic uremic syndrome; Clin Exp Nephrol , 18 , 525-557 (2014)
• 原著論文6: Takanashi J, Taneichi H, Misaki T,et al.; Clinical and radiologic features of encephalopathy during 2011 E coli O111 outbreak in Japan; Neurology , 82 , 564-572 (2014)
• 原著論文7: Iguchi A, Iyoda S, Seto K, et al.; Escherichia coli O-Genotyping PCR: a Comprehensive and Practical Platform for Molecular O Serogrouping; Journal of Clinical Microbiology , 53 (8) , 2427-2432 (2015); 10.1128/JCM.00321-15
• 原著論文8: Iyoda S, Manning SD, Seto K, et al.; Phylogenetic Clades 6 and 8 of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 With Particular stx Subtypes are More Frequently Found in Isolates From Hemolytic Uremic Syndrome Patients Than From Asymptomatic Carriers; Open Forum Infectious Diseases , 1 (2) , ofu061- (2014); 10.1093/ofid/ofu061

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-20
• 更新日: 2018-06-29

収支報告書

• 文献番号: 201420021Z