文献情報
文献番号
201411036A
報告書区分
総括
研究課題名
ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤による骨肉腫がん幹細胞制御を基盤とした新たな革新的がん治療の実用化を目指す前臨床試験
課題番号
H24-実用化（がん）-一般-001
研究年度
平成26(2014)年度
研究代表者(所属機関)
川井 章(独立行政法人国立がん研究センター 骨軟部腫瘍科)
研究分担者(所属機関)
- 落谷 孝広(独立行政法人国立がん研究センター 分子細胞治療研究分野)
- 藤原 智洋(岡山大学病院 新医療研究開発センター（整形外科学）)
- 根津 悠(独立行政法人国立がん研究センター 分子細胞治療研究分野)
- 伊庭 英夫(東京大学医科学研究所 感染・免疫部門 宿主寄生体学分野)
- 伊藤 博(東京農工大学 農学部附属動物医療センター 腫瘍科)
- 尾崎 敏文(岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 生体機能再生・再建学講座 整形外科学)
- 尾崎 充彦(鳥取大学医学部 生命科学科 生体情報機能学講座 病態生化学分野)
- 近藤 格(独立行政法人国立がん研究センター 創薬プロテーオーム研究分野)
- 松田 範昭(株式会社スリー・ディー・マトリックス 事業開発部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 【補助金】 がん対策推進総合研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成26(2014)年度
研究費
80,730,000円
研究者交替、所属機関変更
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研究報告書（概要版）
研究目的
がん組織内におけるがん幹細胞分画をいかにして制御するか、様々ながん種で研究開発が進んでいる。本研究班は平成23年度までにヒト骨肉腫細胞株におけるがん幹細胞分画を単離し、その悪性形質に関与するmiR-133aを特定した。さらにlocked nucleic acid (LNA)によるmiR-133a機能阻害により、薬剤耐性や浸潤能などのがん幹細胞分画における悪性形成の制御を見出した。しかしLNA製剤は海外企業が既に特許を獲得している現状を考慮し、本邦で開発されたS-TuD (Synthetic Tough Decoy RNA)を応用し、骨肉腫悪性形質の制御を試みることを第一の目的とした。また、この構造体を大量合成する方法の確立および医薬品開発に必須である規格試験の確立を第二の目的とした。さらに、骨肉腫におけるmiR-133a及び標的遺伝子発現の臨床的意義の解析を第三の目的とした。
研究方法
本年度は、1)S-TuD合成プロトコールの最適化、2)S-TuD製剤の安定性評価、3)S-TuD製剤の超微量検出法の開発、4)S-TuDの血清中での安定性評価、5)イヌ自然発生骨肉腫症例に対する有効性および安全性試験、6)それに伴う腫瘍内および血清中miRNAの発現解析、7)骨肉腫臨床検体におけるmiR-133a標的遺伝子発現解析を行った。
結果と考察
1) 2’-O-メチル化修飾された長鎖1本鎖RNAの大量合成方法の最適化検討をグラムスケールが製造可能な固相合成システムを用い、数百ミリグラム以上の合成を3つの異なる配列を生産生成したところ、1本鎖部分の合成については前年度よりもさらに高収率に目的産物得られ、精製方法の単純化と2本鎖化の最適化を達成した。また、合成時に生じる不純物は大幅に減少し、精製がこれまでは少なくとも2回以上は必要だったところ、各1本鎖共に陰イオンクロマトグラフィー1回の精製のみで望ましい純度を得ることができた。2)S-TuD凍結乾燥品を-20℃と5℃の2種の温度設定で12か月の安定性を確認した結果、いずれの温度においても保存期間中顕著な差異は認められず、判定基準を逸脱するものは認められなかった。このことから上記の保存条件においてS-TuDの安定性には問題がないことが確認された。3) S-TuD-122特異的primerを用いて半定量的RT-PCR 更には、real-time RT-PCR により行ったところ、fMの濃度まで検出できる系が作成できた。4)S-TuD をマウス血清や、ヒト血清内に添加して37℃で保温して解析したところ、3日以上にわたってほぼ消化されることなく血中で安定に存在することが確認された。5)東京農工大学動物医療センターを中心に全国からイヌ骨肉腫症例を登録するシステムのもとに実施した。ヒトで5年生存率が50～70%であるのに対し、犬での1年生存率は30～60%と、依然として根治を見込める安定した治療法は確立されていない。術前あるいは術後の病理検査で骨肉腫と診断された9症例を対象とし、有効性および安全性評価を継続した。全症例において、S-TuD投与に起因すると思われる副作用は確認されなかった。局所再発が認められた2症例および肺転移が起こり死亡した1症例を除き、投与症例群に大きな毒性は認められなかった。有効性においては、7症例においてS-TuD投与プロトコールが完了し、2症例はプロトコール途中で死亡した。治療プロトコールが完遂した7例のうち5例において、転移や再発は現在までに認められていない。生存7例について経過観察を継続している。6)腫瘍組織を採材出来た5例全例にmiR-133aの発現が認められた。解析できた1例は原発巣と比べ転移巣におけるmiR-133aは約3倍亢進していた。また、別の症例においては正常組織と腫瘍組織との比較が可能であり、前者に比べて後者で遥かに高いmiR-133aの発現が観察された。S-TuD-133a投与前後で投与前と比較し1ないし2回投与後の発現量は有意に低下した。7)ヒト骨肉腫組織におけるANXA2発現は、腫瘍細胞の細胞膜および細胞質に観察され、ANXA2陽性腫瘍細胞は、類骨形成能の高い部位で比較的多く観察された。解析した10例中、ANXA2陽性例は肺転移陽性群において4例中１例（25.0％）、一方肺転移陰性例群において6例中4例（66.7％）と前者で低値を示しており、ANXA2発現低下が肺転移に関与することが示唆された。
結論
新規miRNA阻害剤S-TuDの骨肉腫に対する臨床応用に向けての基盤が構築された。将来的には骨肉腫の範疇を超え、miRNA発現異常を示す様々な悪性腫瘍やその他の疾患に対するS-TuDの応用が期待される。
公開日・更新日
公開日
2015-09-08
更新日
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