文献情報
文献番号
201333007A
報告書区分
総括
研究課題名
肝疾患病態指標血清マーカーの開発と迅速、簡便かつ安価な測定法の実用化
課題番号
H23-実用化-肝炎-一般-011
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
成松 久(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
研究分担者(所属機関)
- 田中 靖人(公立大学法人名古屋市立大学大学院 医学研究科)
- 是永 匡紹(独立行政法人国立国際医療研究センター 肝炎・免疫研究センター)
- 伊藤 浩美(公立大学法人福島県立医科大学 生化学講座)
- 溝上 雅史(独立行政法人国立国際医療研究センター 肝炎・免疫研究センター)
- 伊藤 清顕(学校法人愛知医科大学 医学部 内科学講座（消化器内科）)
- 八橋 弘(独立行政法人国立病院機構 長崎医療センター 臨床研究センター)
- 坂元 亨宇(慶應義塾大学 医学部 病理学教室)
- 武冨 紹信(北海道大学大学院 医学研究科)
- 梶 裕之(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 久野 敦(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 栂谷内 晶(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 佐藤 隆(独立行政法人産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センター)
- 髭 修平(北海道厚生農業協同組合連合会札幌厚生病院 第三消化器科)
- 上野 義之(国立大学法人山形大学 医学部 内科学第二（消化器内科学）講座)
- 泉 並木(日本赤十字社 武蔵野赤十字病院 消化器科)
- 松本 晶博(国立大学法人信州大学医学部附属病院 消化器内科)
- 市田 隆文(順天堂大學醫學部附属静岡病院 消化器内科)
- 熊田 卓(大垣市民病院 消化器内科)
- 日野 啓輔(川崎医科大学 肝胆膵内科学)
- 阿部 雅則(愛媛大学大学院 医学系研究科 地域医療学寄附講座)
- 調 憲(国立大学法人九州大学大学院 医学研究院)
- 米田 政志(学校法人愛知医科大学 医学部 内科学講座（消化器内科）)
- 今井 康陽(地域医療支援病院 市立池田病院 消化器内科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（肝炎関係研究分野）
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
38,462,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
1. 新規肝疾患病態指標マーカー開発：(1) 昨年度、肝がん患者血清を用いて疾患に伴う糖鎖変化が検証された候補タンパク質(CSF1R) については、臨床情報の明確な患者血清を用いた小規模な有効性検証を継続的に行う。
(2) 昨年度同定した、AFP非産生肝がん培養細胞反応性レクチンに結合する糖タンパク質(ペプチド) 群より、マーカー候補分子を選別し、検証を行う。
(3) がん細胞表層に出現する糖タンパク質分子を同定することを念頭に置き、肝細胞がん患者組織標本のレクチンアレイ解析を実施する。
2. 多施設多検体検証：肝線維化の進展度を血清で測定可能な糖タンパク質血清マーカー(WFA+-M2BP)簡便測定系の有効性評価判定試験の位置づけとして、参画大学・臨床機関より集約された血清サンプルを昨年度に引き続き測定し、肝生検組織との比較、現在の他マーカーとの比較や最適な組み合わせを探り、身体的負担が大きいとされる肝生検に代わる、新たな検査方法の実用化をはかることを目的とする。
(2) 昨年度同定した、AFP非産生肝がん培養細胞反応性レクチンに結合する糖タンパク質(ペプチド) 群より、マーカー候補分子を選別し、検証を行う。
(3) がん細胞表層に出現する糖タンパク質分子を同定することを念頭に置き、肝細胞がん患者組織標本のレクチンアレイ解析を実施する。
2. 多施設多検体検証：肝線維化の進展度を血清で測定可能な糖タンパク質血清マーカー(WFA+-M2BP)簡便測定系の有効性評価判定試験の位置づけとして、参画大学・臨床機関より集約された血清サンプルを昨年度に引き続き測定し、肝生検組織との比較、現在の他マーカーとの比較や最適な組み合わせを探り、身体的負担が大きいとされる肝生検に代わる、新たな検査方法の実用化をはかることを目的とする。
研究方法
1. 新規肝疾患病態指標マーカー開発：(1) 構築済みサンドイッチELISAシステム(WFA+-CSF1R検出系)を利用して、小規模な有効性検証を行った。その際、CSF1Rの総量も測定し、WFA結合CSF1Rの割合を算出し、検証に用いた。
(2) 新規AFP非産生肝がんマーカーの探索を行った。質量分析により同定済みの糖タンパク質マーカー候補分子群から、バイオインフォマティクスなどによって有望と思われる候補をさらに選択した。残った候補分子については、レクチンアレイ分析により、各分子に肝疾患疾患による糖鎖変化が生じているかを解析した。
(3) 肝がん患者組織のがん部位と線維化部位の両方を含む薄切切片を作製し（5μm厚）、レーザーマイクロダイセクションを用い、そのがん部および非がん部から1mm2の領域ずつ組織片を単離し、レクチンアレイ解析に用いた。データは規格化後、対応ありの2群比較によってP<0.05を示すレクチンを候補レクチンとして選抜し、レクチン組織染色により、有意差の妥当性を検証した。
2. 多施設多検体検証：参画臨床機関・大学より提案され、研究代表者および臨床機関統括者により承認された研究課題を対象に、肝線維化マーカーWFA+-M2BPの測定を行った。サンプルは各施設より臨床機関統括者へ集約され、連結可能二重匿名化後、測定機関である産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センターへ移送された。測定値はカットオフインデックス値に換算され、速やかに提案者へ報告された。提案者は測定値をもとに、各課題における検証作業を行った。
(2) 新規AFP非産生肝がんマーカーの探索を行った。質量分析により同定済みの糖タンパク質マーカー候補分子群から、バイオインフォマティクスなどによって有望と思われる候補をさらに選択した。残った候補分子については、レクチンアレイ分析により、各分子に肝疾患疾患による糖鎖変化が生じているかを解析した。
(3) 肝がん患者組織のがん部位と線維化部位の両方を含む薄切切片を作製し（5μm厚）、レーザーマイクロダイセクションを用い、そのがん部および非がん部から1mm2の領域ずつ組織片を単離し、レクチンアレイ解析に用いた。データは規格化後、対応ありの2群比較によってP<0.05を示すレクチンを候補レクチンとして選抜し、レクチン組織染色により、有意差の妥当性を検証した。
2. 多施設多検体検証：参画臨床機関・大学より提案され、研究代表者および臨床機関統括者により承認された研究課題を対象に、肝線維化マーカーWFA+-M2BPの測定を行った。サンプルは各施設より臨床機関統括者へ集約され、連結可能二重匿名化後、測定機関である産業技術総合研究所 糖鎖医工学研究センターへ移送された。測定値はカットオフインデックス値に換算され、速やかに提案者へ報告された。提案者は測定値をもとに、各課題における検証作業を行った。
結果と考察
1. 新規肝疾患病態指標マーカー開発：(1) 各種肝患者血清を用いた正当性検証の結果、WFA+-CSF1Rは、肝硬変の予後予測や肝がんの発症リスク予測の指標としての有用性が示された。
(2) バイオインフォマティクスにより、数十分子にまで候補タンパク質を絞り込み、うち6種の分子について、患者血清を対象にレクチンアレイ分析を実施した。このうち1種は、AFP低値を示す血清においても高い値を示したため、AFPを補完する肝がんマーカーである可能性が示唆された。
(3) がん部で有意にシグナルが増すレクチンXをみとめ、組織染色により、レクチンXはがん細胞の特定領域を染めることが判明した。
2. 多施設多検体検証：各機関より15の課題が提案され、HBV、HCV感染ないし非感染の慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん患者および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD) を対象として、約6,000サンプルの測定が行われた。各課題のデータ解析の結果、線維化ステージF3以上で今回検証した他の非侵襲型線維化評価技術(LSM、ARFI) およびインデックス(APRI、FIB-4) と遜色ない、もしくは凌駕する肝線維化との相関が得られた。また、インターフェロン治療後経過観察例などの測定結果から、肝発がんリスクを有する症例の囲い込みへの有効性を見出した。
(2) バイオインフォマティクスにより、数十分子にまで候補タンパク質を絞り込み、うち6種の分子について、患者血清を対象にレクチンアレイ分析を実施した。このうち1種は、AFP低値を示す血清においても高い値を示したため、AFPを補完する肝がんマーカーである可能性が示唆された。
(3) がん部で有意にシグナルが増すレクチンXをみとめ、組織染色により、レクチンXはがん細胞の特定領域を染めることが判明した。
2. 多施設多検体検証：各機関より15の課題が提案され、HBV、HCV感染ないし非感染の慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん患者および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD) を対象として、約6,000サンプルの測定が行われた。各課題のデータ解析の結果、線維化ステージF3以上で今回検証した他の非侵襲型線維化評価技術(LSM、ARFI) およびインデックス(APRI、FIB-4) と遜色ない、もしくは凌駕する肝線維化との相関が得られた。また、インターフェロン治療後経過観察例などの測定結果から、肝発がんリスクを有する症例の囲い込みへの有効性を見出した。
結論
新規線維化マーカーWFA+-M2BPの臨床的有用性が見出された。保険収載へ向けた肝線維化検査のガイドラインの提案が期待できる。加えて、肝硬変の予後予測や肝がんの発症リスク予測に有効なマーカーWFA+-CSF1Rの、小規模有効性検証を終えた。今後の大規模解析により、用途がより明確になることが望まれる。がんマーカーについては、AFPやPIVKAIIなど、既存のものとは異なる用途が期待できる候補分子が複数同定された。今後の正当性検証試験及び有効性検証試験の結果が待たれる。
公開日・更新日
公開日
2017-01-20
更新日
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