次世代遺伝子解析による希少難治性循環器疾患の診断治療法の開発と臨床実用化に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201331009A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 次世代遺伝子解析による希少難治性循環器疾患の診断治療法の開発と臨床実用化に関する研究
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-009
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 小室 一成(国立大学法人 東京大学大学院 医学系研究科 循環器内科学)

研究分担者(所属機関)

• 朝野　仁裕(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　循環器内科学 )
• 澤　芳樹(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　心臓血管外科学 )
• 油谷　浩幸(国立大学法人　東京大学　先端科学技術研究センター)
• 扇田　久和(国立大学法人　滋賀医科大学　医学部)
• 李　鍾國（リ　ショウコク）(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　心血管再生医学 )
• 山崎　悟(国立循環器病研究センター　細胞生物学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 61,539,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　難治性循環器疾患の原因遺伝子は多岐にわたる。未だ殆どが未解明な原因のため詳細な増悪機序を同定できぬまま高度医療に臨まざるを得ない。そこで効率良く心疾患増悪の原因を解明することができれば、早期治療と予後改善がもたらす社会的、経済的効果は計り知れないものがある。遺伝性が濃厚な希少難治性疾患の家系症例を対象に、原因となる新規rare variantを同定し、診断および治療薬標的を見出し、臨床実用化することを目指す。既存のシーズ候補のみならず、拠点施設と連携し複数の未解析家系から迅速に新規遺伝子同定を行う本ゲノム創薬研究は、今後の臨床実用化研究のモデルとなり得る。

研究方法

　迅速なゲノム医療への応用のため、既知変異の迅速な鑑別除外により、新規変異を持つ確率の高い症例に次世代解析を行い、新規分子ないし変異に対する機動力ある表現型機能解析と同定遺伝情報の臨床応用への時間短縮をはかる。具体的には、難治性循環器疾患の遺伝性家系及び心不全症例の生体試料バンクの利用し、ゲノム解析の精度と速度を高める方策をとるとともに、心筋症マウス解析とゼブラフィッシュイメージングの利用によるin vivo 検証の迅速化や、生化学的解析法を利用した独自の生理活性物質同定およびシーズ探索技術の利用、そしてゲノム創薬へ向けてヒトiPS細胞による検証も用いた治療標的リガンド開発と臨床実用化など、得られたゲノム情報を迅速かつ有効に診療に結実させるよう研究を進める。

結果と考察

遺伝性疾患を疑う家系としては心筋症・不整脈合わせて、68家系・164症例、の症例を収集した。症例提供協力施設も倫理委員会承認を得て、豊富な症例登録環境となった。また、家系ではなくとも、孤発症例のうち、二次性心筋症を除外したものから約150症例の検体収集を行った。
　得られたfastqファイル形式のデータをもとにLinuxサーバーシステムを用いてバリアント検出ができるパイプラインを既存のスクリプトと独自開発のスクリプトを組み合わせ、遺伝性心疾患既知遺伝子もリスト化した上で、心血管特異的に発現する遺伝子の同定を効率良く行うことに適したパイプラインを構築した。既にマッピング、バリアント検出、リードクオリティの検証などの情報解析パイプラインは既存オープンソースのスクリプトに本解析に沿ったスクリプトも加え、独自のパイプラインとして構築を完了した。アノテーション以降の遺伝子機能および家系情報も含めた解析が可能となるようにした情報解析システムの構築に向けて、国際共同研究協議も開始した。
　上記解析システムを用いながら、採取した血液サンプルからゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンス解析を行い、配列解読、配列解析（マッピング、バリアント検出）を終えた家系は2年目終了時点で26家系94症例となり、最終年度終了時点で150症例を超える解析を実施した。
　心筋細胞機能変化を示す重要な分子をスクリーニングし、心筋症発症に関わると想定される新規遺伝子を同定（遺伝子①）した。各遺伝子について家族発症を認める別家系において、孤発例ながら同遺伝子にnon-synonymus変異を認める症例などを突き止めることに成功した。難治性不整脈の家系に対して新規遺伝子②を同定した。Xenopusを用いたパッチクランプ法による不整脈遺伝子機能解析を行った。当初の家系症例とは別家系に、本遺伝子の別部位にnon-synonymous変異を同定した。

結論

　臨床情報と連結可能匿名化された心筋症ゲノム解析を実施し、豊富な症例バンクを構築することに成功した。それらの情報を利用し新規原因遺伝子を２つ同定することに成功した。片方は創薬シーズ探索に発展した研究に進み、他方は既に化合物を得て、機能解析を実施する段階に進んでいる。本研究を通じて遺伝心血管疾患の原因解明とその応用において、情報解析パイプラインの確立、新規遺伝子同定と創薬標的・シーズ探索研究へと進み、特異的化合物同定にいたる当初の目標を超える成果を上げることができた。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-21
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201331009B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 次世代遺伝子解析による希少難治性循環器疾患の診断治療法の開発と臨床実用化に関する研究
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-009
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 小室 一成(国立大学法人 東京大学大学院 医学系研究科 循環器内科学)

研究分担者(所属機関)

• 朝野　仁裕(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　循環器内科学 )
• 澤　芳樹(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　心臓血管外科学 )
• 油谷　浩幸(国立大学法人　東京大学　先端科学技術研究センター)
• 扇田　久和(国立大学法人　滋賀医科大学　医学部)
• 李　鍾國（リ　ショウコク）(国立大学法人　大阪大学大学院　医学系研究科　心血管再生医学)
• 山崎　悟(国立循環器病研究センター　細胞生物学部)
• 塩島　一朗(関西医科大学　医学部　内科学第二講座)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　遺伝性が濃厚な希少難治性疾患に全エクソーム解析を適用し、情報解析パイプラインの開発と家系症例を対象に新規原因変異の同定を行う。難治性循環器疾患の原因遺伝子は多岐にわたり未解明な疾患も未だ多く、症例の殆どが厳密に原因を同定できぬまま高度医療に臨まざるを得ない。この現状に対し、先進的技術による早期診療が予後改善へもたらす社会的、経済的効果は計り知れない。
　循環器特有の臨床に適した解析ノウハウを蓄積し、情報解析パイプラインの開発と新規遺伝子変異の同定、その分子機能解析を実施する。希少難治疾患の新規遺伝子を標的とした創薬シーズ探索研究を経て、診断技術の向上と新規機序から見出される治療標的の探索を実施しそれらの臨床実用化を目指す。

研究方法

　本研究では次世代シーケンス解析の実践と同定遺伝子情報を診断治療に迅速に応用するため以下に挙げる独創的手法を利用した研究を実施する。迅速なゲノム医療への応用のため、既知変異の迅速な鑑別除外により、新規変異を持つ確率の高い症例に次世代解析を行い、新規分子ないし変異に対する機動力ある表現型機能解析と同定遺伝情報の臨床応用への時間短縮をはかる。難治性循環器疾患の遺伝性家系及び心不全症例の生体試料バンクの利用し、ゲノム解析の精度と速度を高める方策をとり、さらに同定した遺伝子の独創的な機能解析を実施する。ゼブラフィッシュ実験系、Dual-CCD／LED光源／倒立型リサーチ顕微鏡－細胞機能解析装置、世界に先駆け新規に開発実用化に成功したin vivo FRETプローブ－イメージング解析システムなど、心臓機能の生体機能解析、迅速化、生化学的解析法を利用した生理活性物質同定およびシーズ探索を行う。

結果と考察

　難治性遺伝性循環器疾患を中心に心筋症・不整脈合わせて、68家系・164症例の症例を収集し、それぞれに全エクソーム解析を実施した。情報解析パイプラインについては、得られたfastqファイル形式のデータをもとにLinuxサーバーシステムを用いてバリアント検出ができるパイプラインを既存のスクリプトと独自開発のスクリプトを組み合わせ、遺伝性心疾患既知遺伝子もリスト化した上で、心血管特異的に発現する遺伝子の同定を効率良く行うことに適したパイプラインを構築した。アノテーション以降の遺伝子機能および家系情報も含めた解析が可能となるようにした情報解析システムの構築に向けて、国際共同研究協議も開始した。遺伝統計学的手法を駆使した本解析法は、近年の核家族化が進み家系解析が困難な症例でも対応できるようデザインされており、特にトリオ解析などの実施が困難な拡張型心筋症の解析などに威力を発揮するものと考えられる。
　同定した新規遺伝子も機能解析を含めて発展的な研究成果を得ることができた。心筋細胞機能変化を示す重要な分子をスクリーニングし、心筋症発症に関わると想定される新規遺伝子を同定（遺伝子①）し、各遺伝子について家族発症を認める別家系において、孤発例ながら同遺伝子にnon-synonymus変異を認める症例などを突き止めることに成功した。また難治性不整脈の家系に対して行った解析では新規遺伝子②を同定し、Xenopusを用いたパッチクランプ法による不整脈遺伝子機能解析を行った。当初の家系症例とは別家系に、本遺伝子の別部位にnon-synonymous変異を同定した。これら両遺伝子について、前者は創薬シーズ探索に発展した研究に進み、後者は既に化合物を得て、機能解析を実施する段階に進んだ。本研究を通じて遺伝心血管疾患の原因解明とその応用において、情報解析パイプラインの確立、新規遺伝子同定と創薬標的・シーズ探索研究へと進み、特異的化合物同定にいたる当初の目標を超える成果を上げることができた。

結論

　最重症心不全症例（心臓移植、最新型人工心臓、高度先進医療）の特性を活かし、臨床データと共に豊富なゲノム解析症例を蓄積し、迅速なゲノム解析可能にする情報解析システム系を構築した。情報解析パイプラインは遺伝統計学的手法を加味した独自性と汎用性の高いものとなり国際共同研究へと発展した。それらの技術を利用し新規原因遺伝子を２つ同定することに成功し、創薬標的・シーズ探索研究に発展した。開発確度を高めるためhigh throughput screeningからhit 化合物の同定、chemical probeの合成、in vitro / in vivo薬理実験系、動物を用いたin vivo POC を経て行われるLead Optimizationまでを想定し、戦略立った開発の取り組みを開始した。遺伝心血管疾患の原因解明とその応用から、情報解析パイプラインの確立、新規遺伝子同定と創薬標的・シーズ探索研究へと進み、特異的化合物同定に至り、当初の目標を超える成果を上げることができた。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-21
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201331009C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 遺伝統計学的手法を加味した独自性と汎用性の高い情報解析パイプライン開発の国際共同研究へ発展した。本技術を利用し新規原因遺伝子を２つ同定し創薬標的・シーズ探索研究に発展した。HTS解析からヒット化合物同定、ケミカルプローブ合成、細胞/動物薬理実験、生体POC を経て行われるリード化合物の最適化までを計画する創薬開発研究へと発展した。情報解析パイプラインの確立から、遺伝心血管疾患の新規遺伝子同定と創薬標的・シーズ探索研究、特異的化合物同定へと至った。また臨床応用可能な遺伝子解析法を確立した。
• 臨床的観点からの成果: 生活の質低下と生命予後の悪化に直結し、高額デバイス装着や外科治療を余儀なくされる難治性心不全、不整脈の原因解明の手法を確立した。難病遺伝子解析において同定した遺伝子は、産学連携の創薬標的/シーズ探索に向けた共同開発研究が開始された。早期診断と治療最適化は重症化予防医療にも大きく貢献する。臨床現場への遺伝子情報の還元は必須であり、数～十万人を数える循環器全体の難病疾患において臨床、医療経済、社会的必要性を満たす循環器分野ゲノム解析拠点が形成された。また臨床経過と関連する遺伝子変異を複数同定した。
• ガイドライン等の開発: 拡張型心筋症をはじめとする疾患は未だ個々の原因に最適化された治療は行われていない。本研究を継続し国内および国外のデータをもとにした原因遺伝子同定と精密な疾患分類を実現し、加えてゲノム情報に連結匿名化された臨床情報を得ることにより、最適化された新しい心疾患治療ガイドラインの作成が可能となる。すでに臨床的予後の予測に役立つ遺伝子変異を複数同定しており、これらの科学的根拠を確立させてガイドラインへ反映させる。
• その他行政的観点からの成果: 本研究において実現し得た原因遺伝子同定から創薬開発研究に至る研究モデルは、今後のゲノム解析研究がもたらす知的財産とそれを利用した創薬開発研究のモデルとなり得る。各疾患ごとに専門医により詳細に分類された臨床情報とゲノム情報が集積する拠点研究施設の配置は、効率良い創薬開発研究と診療の最適化を実施する上で必須であることが示された。さらに循環器領域における新規創薬標的の存在を証明し得た。
• その他のインパクト: 本研究を通じて全国循環器ゲノム解析ネットワークを構成するために必要な難治性疾患研究班、日本循環器各学会の研究施設が分担となったゲノム解析研究の枠組みが構築され、統一フォーマットの遺伝子解析による解析情報結果の臨床現場への還元と情報統合、そして診療ガイドラインへの反映を実現する基盤が整備された。今後この枠組みで希少難治性循環器疾患の診断・治療法の開発を継続して進めることが可能であり、我が国から世界に先駆けてこの分野の研究開発をリードしていく。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 9件
• その他論文(和文): 7件
• その他論文(英文等): 24件
• 学会発表(国内学会): 19件
• 学会発表(国際学会等): 14件
• その他成果(特許の出願): 2件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kioka H, et al.; Evaluation of intramitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation.; Proc Natl Acad Sci U S A. , 111 (1) , 273-278 (2014); 10.1073/pnas.1318547111.
• 原著論文2: Imai A. et al.; Comprehensive metagenomic approach for detecting causative microorganisms in culture-negative infective endocarditis.; Int J Cardiol. , 172 (2) , e288-e289 (2014); 10.1016/j.ijcard.2013.12.197.
• 原著論文3: Matsuoka K, et al.; Noninvasive and quantitative live imaging reveals a potential stress-responsive enhancer in the failing heart.; FASEB J. , 28 (4) , 1870-1879 (2014); 10.1096/fj.13-245522.
• 原著論文4: Kikuchi Y, et al.; Aberrantly methylated genes in human papillary thyroid cancer and their association with BRAF/RAS mutation.; Front Genet. , (4) , 271- (2013); 10.3389/fgene.2013.00271.
• 原著論文5: Kon A, et al.; Recurrent mutations in multiple components of the cohesin complex in myeloid neoplasms.; Nat Genet. , 45 (10) , 1232-1237 (2013); doi: 10.1038/ng.2731.
• 原著論文6: Naito AT, et al.; Complement C1q activates canonical Wnt signaling and promotes aging-related phenotypes.; Cell , 149 (6) , 1298-1313 (2012); 10.1016/j.cell.2012.03.047.
• 原著論文7: Yamazaki S, et al.; Ablation of Rnf213 retards progression of diabetes in the Akita mouse.; Biochem Biophys Res Commun. , 432 (3) , 519-525 (2013); 10.1016/j.bbrc.2013.02.015.
• 原著論文8: Hayashi T, et al.; Higd1a is a positive regulator of cytochrome c oxidase.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 112 (5) , 1553-1558 (2015); 10.1073/pnas.1419767112.
• 原著論文9: Kanzaki M, Asano Y, Ishibashi-Ueda H, Oiki E, Nishida T, Asanuma H, Kato H, Oka T, et al.; A Development of Nucleic Chromatin Measurements as a New Prognostic Marker for Severe Chronic Heart Failure.; PLoS One. , 11 (2) , e0148209- (2016); 10.1371/journal.pone.0148209. eCollection 2016.
• 原著論文10: Morita H, Komuro I.; A Strategy for Genomic Research on Common Cardiovascular Diseases Aiming at the Realization of Precision Medicine: Personal Insights and Perspectives.; Circulation Research , 119 (8) , 900-903 (2016); 10.1161/CIRCRESAHA.116.309802.
• 原著論文11: Amiya E, Morita H, Hatano M, et al.; Fukutin gene mutations that cause left ventricular noncompaction.; International Journal of Cardiology , 222 , 727-729 (2016); 10.1016/j.ijcard.2016.08.011.
• 原著論文12: Hara H, Takeda N, Morita H, et al.; Three novel BMPR2 mutations associated with advanced pulmonary arterial hypertension.; Human Genome Variation , 4 , 17010- (2017); 10.1038/hgv.2017.10.
• 原著論文13: Oshima T, Hara H, Takeda N, et al.; A novel mutation of NFIX causes Sotos-like syndrome (Malan syndrome) complicated with thoracic aortic aneurysm and dissection.; Human Genome Variation , 4 , 17022- (2017); 10.1038/hgv.2017.22.
• 原著論文14: Tobita T, Nomura S, Morita H, et al.; Identification of MYLK3 mutations in familial dilated cardiomyopathy.; Scientific Reports , 7 , 17495- (2017); 10.1038/s41598-017-17769-1.
• 原著論文15: Tobita T, Nomura S, Fujita T, et al.; Genetic basis of cardiomyopathy and the genotypes involved in prognosis and left ventricular reverse remodeling.; Scientific Reports , 8 , 1998- (2018); 10.1038/s41598-018-20114-9.

公開日・更新日

• 公開日: 2016-06-01
• 更新日: 2019-05-27

収支報告書

• 文献番号: 201331009Z
• 報告年月日: 2013年05月01日

収入

• (1)補助金交付額: 80,000,000円
• (2)補助金確定額: 76,955,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 3,045,000円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	43,467,894円
		人件費・謝金	3,755,221円
		旅費	0円
		その他	11,271,345円
	間接経費		18,461,000円
	合計		76,955,460円

備考

備考

返金諸手続によるものとする。直接経費のうち、3,044,540円返金予定であったが、返金諸手続で千円未満を切捨とするため、手続後の直接経費が58,494,000円・間接経費18,461,000円合わせて76,955,000円となった。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-21
• 更新日: -