次世代シーケンサーを用いた遺伝性ミオパチーの原因解明

文献情報

• 文献番号: 201331008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 次世代シーケンサーを用いた遺伝性ミオパチーの原因解明
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-008
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 西野 一三(独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 神経研究所疾病研究第一部)

研究分担者(所属機関)

• 野口　悟(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第一部 )
• 林　由起子(東京医科大学医学部医学科　神経生理学講座)
• 後藤　雄一(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第二部 )
• 小牧　宏文(独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　病院小児神経診療部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 53,847,000円
• 研究者交替、所属機関変更: 研究分担者 林由起子 所属機関 (独)国立精神・神経医療研究センター神経研究所 疾病研究第一部（平成25年7月31日まで） →東京医科大学医学部医学科 神経生理学講座（平成25年8月1日以降）

研究報告書（概要版）

研究目的

原因不明の遺伝性ミオパチー例に対して、次世代シーケンサーを用いたエクソームのリシーケンス解析を行って原因遺伝子を同定し、分子病態を明らかにする。

研究方法

(1) 全エクソーム解析
(2) 網羅的既知遺伝子スクリーニング
(3) 遺伝性ミオパチー患者臨床情報の集積
(4) 遺伝子変異病原性の実証実験
(5) ミトコンドリアミオパチーの原因解明

結果と考察

(1) 全エクソーム解析
a) Tutubular aggregate ミオパチー
3家系にORAI1遺伝子変異、1家系にSTIM1遺伝子変異、2家系にGFPT1遺伝子変異を見出した。
b) α-ジストログリカノパチー
11例でbiallelicな変異を同定した。8例の日本人患者のうち、GTDC2変異は3例に、ISPD変異は2例に、DAG1、FKRP、GMPPB変異はそれぞれ1例に見いだされた。
c) ネマリンミオパチー
日本人患者でKLHL40の共通変異が存在し、本邦乳児重症型ネマリンミオパチーの原因としてACTA1に次いで頻度の高い原因遺伝子であることを明らかにした。
d) EMARDD
一例でMEGF10遺伝子にnull変異を認めた。

(2)網羅的既知遺伝子スクリーニング
39遺伝子について全エクソンのターゲットリシークンシングを行い、網羅的既知原因遺伝子変異スクリーニングを行った。120例の変異未確定の先天性ミオパチー例の約半数で変異を同定した。

(3) 遺伝性ミオパチー患者臨床情報の集積
遺伝性ミオパチーの原因解明の基礎となる臨床データの集積を、既知の筋病理学的な特徴の分類に基づいて行った。

(4) 遺伝子変異病原性の実証実験
HAP1細胞にCRISPR/Cas9システムを用いてISPD、FKTN、FKRP、GMPPB遺伝子KO細胞を作製することに成功し、病原性をスクリーニングに活用できることを示した。

(5) ミトコンドリアミオパチーの原因解明
高乳酸血症を伴い脳MRI画像で、大脳白質に嚢胞性病変を認める白質障害例の2家系3例で、遺伝子Xにナンセンス変異を含むbiallelicな変異を認めた。

結論

次世代シークエンサーを導入して解析パイプラインを構築し、全エクソーム解析とターゲットリシークンシングを行える体制を整えた。遺伝性筋疾患の新規原因遺伝子変異同定および既知遺伝子変異同定の何れにおいても、一定の効率を示し、少なくとも2つの新規原因遺伝子を同定し、6つの既知遺伝子について、本邦初例を見いだした。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201331008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 次世代シーケンサーを用いた遺伝性ミオパチーの原因解明
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-008
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 西野 一三(独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 神経研究所疾病研究第一部)

研究分担者(所属機関)

• 野口　悟( 独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第一部 )
• 林　由起子(東京医科大学医学部医学科　神経生理学講座)
• 後藤　雄一( 独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター　神経研究所疾病研究第二部 )
• 小牧　宏文( 独立行政法人　国立精神・神経医療研究センター病院　小児神経診療部)
• 本村　和嗣(大阪大学　微生物病研究所　日本-タイ感染症共同研究センター　ウイルス感染部門)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: 研究分担者 林由起子 所属機関 (独)国立精神・神経医療研究センター神経研究所 疾病研究第一部（平成25年7月31日まで） →東京医科大学医学部医学科 神経生理学講座（平成25年8月1日以降） 研究分担者変更 本村和嗣（平成25年1月31日まで）→西野一三（平成25年2月1から本村和嗣の分担する研究項目を西野一三が担当する）

研究報告書（概要版）

研究目的

原因不明の遺伝性ミオパチー例に対して、次世代シーケンサーを用いたエクソームの
リシーケンス解析を行って原因遺伝子を同定し、分子病態を明らかにする。

研究方法

(1) 全エクソーム解析
(2) 網羅的既知遺伝子スクリーニング
(3) 遺伝性ミオパチー患者臨床情報の集積
(4) 遺伝子変異病原性の実証実験
(5) ミトコンドリアミオパチーの原因解明
を柱として研究を推進した。

結果と考察

(1) 全エクソーム解析
a) Tutubular aggregate ミオパチー
Tubular aggregates (TAs)を病理学的特徴とする遺伝性ミオパチー（Tubular aggregate myopathy (TAM) ）を有する15家系（罹患者18名、非罹患者10名）を対象に全エクソーム解析を行った。その結果、3家系にORAI1遺伝子変異、1家系にSTIM1遺伝子変異、2家系にGFPT1遺伝子変異を見出した。
b) α-ジストログリカノパチー
筋病理学的および免疫組織化学的ににα-ジストログリカノパチーと診断された例で、かつ、福山型の共通変異である3-kb挿入変異のない20例を対象として全エクソーム解析を行い、11例でbiallelicな変異を同定した。11例のうち、8例が日本人患者、2例がサウジアラビア人、1例はマレーシア人である。日本人患者では、GTDC2変異は3例に、ISPD変異は2例に、DAG1、FKRP、GMPPB変異はそれぞれ1例に見いだされた。特にGTDC2に関しては、全員が共通変異を有していた。このうち2例はこの共通変異のホモ接合体で、残る一例は複合ヘテロ接合体であった。これまでにGTDC2変異の報告は1報のみで、最重症の先天性筋ジストロフィーであるWalker-Warburg症候群の病態を呈している。一方我々の見いだした例は、何れも高CK血症のみで明らかな筋力低下は認めなかった。
c) ネマリンミオパチー
全エクソーム解析で見いだした新たな原因遺伝子KLHL40、KLHL41、他について変異スクリーニングを行った結果、KLHL40には日本人患者で共通変異が存在し、本邦乳児重症型ネマリンミオパチーの原因としてACTA1に次いで頻度の高い原因遺伝子であることを明らかにした（Am J Hum Genet 2013）。一方、KLHL41変異例は1例も認められなかった（Am J Hum Genet 2013）。
d) Early onset myopathy, areflexia, res-piratory distress and dysphagia (EMARDD)
EMARDDは最近確立された疾患概念でMEGF10遺伝子変異の機能喪失型変異によって起こることが知られている。原因不明の遺伝性ミオパチーの一例に全エクソーム解析を行い、MEGF10遺伝子にnull変異を認めた。臨床的にもEMRADDとして矛盾せず、東半球で初めての患者同定である。


(2)網羅的既知遺伝子スクリーニング
120例の変異未確定の先天性ミオパチー例からゲノムDNAを抽出した。39遺伝子について全エクソンのターゲットリシークンシングを行い、網羅的既知原因遺伝子変異スクリーニングを行った結果、約半数で変異を同定し得た。

(3) 遺伝性ミオパチー患者臨床情報の集積
遺伝性ミオパチーの原因解明の基礎となる臨床データの集積を、既知の筋病理学的な特徴の分類に基づいて行った。

(4) 遺伝子変異病原性の実証実験
HAP1細胞にCRISPR/Cas9システムを用いてISPD、FKTN、FKRP、GMPPB遺伝子KO細胞を作製することに成功した。現在、これに同定されたミスセンス変異を導入して、病原性をスクリーニング中である。

(5) ミトコンドリアミオパチーの原因解明
高乳酸血症を伴い脳MRI画像で、大脳白質に嚢胞性病変を認める白質障害例の2家系3例では、別のミトコンドリア病の原因遺伝子として報告されている遺伝子に、ナンセンス変異を含むbiallelicな変異を認めた。現在、この遺伝子が原因遺伝子であるとの仮説の下、生化学的解析を進めている。

結論

次世代シークエンサーを導入して解析パイプラインを構築し、全エクソーム解析とターゲットリシークンシングを行える体制を整えた。次世代解析技術自体に、まだ技術的に克服しなければならない側面はあるものの、遺伝性筋疾患の新規原因遺伝子変異同定および既知遺伝子変異同定の何れにおいても、一定の効率を示すことが示された。その成果として、共同研究も含めて、少なくとも2つの新規原因遺伝子を同定すると共に、少なくとも6つの既知遺伝子について、初めての本邦例を見いだすことに成功した。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201331008C

収支報告書

• 文献番号: 201331008Z
• 報告年月日: 2015年04月09日

収入

• (1)補助金交付額: 70,000,000円
• (2)補助金確定額: 70,000,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	31,980,112円
		人件費・謝金	18,867,916円
		旅費	2,798,540円
		その他	200,432円
	間接経費		16,153,000円
	合計		70,000,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2018-05-22
• 更新日: -