遺伝性難治疾患の網羅的エクソーム解析拠点の構築

文献情報

• 文献番号: 201331005A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 遺伝性難治疾患の網羅的エクソーム解析拠点の構築
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-005
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 松本 直通(横浜市立大学 医学研究科 環境分子科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 池川志郎(理化学研究所統合生命医科学研究センター)
• 高橋篤(理化学研究所統合生命医科学研究センター)
• 福嶋義光(信州大学医学部遺伝医学予防医学講座)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 153,847,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は、遺伝性疾患を対象に、網羅的全エクソーム解析により原因遺伝子を解明することを目的とする。本拠点班が他の一般研究班や奨励研究班と連携して疾患遺伝子解明を進め、全エクソーム解析用共通プロトコールを策定する

研究方法

1.症例集積と他の研究班との連携：骨系統疾患コンソーシアム・胎児骨系統疾患ネットワーク、臨床遺伝ネットワークなどを通じ症例を集積した。既に実績と定評のある専門家ネットワークを通じて正確な診断が成され、かつ詳細な臨床情報を得られる症例群を多数集積する。
2.全エクソーム解析：Agilent社のSureSelect等を用いてヒトゲノム全遺伝子のエクソン領域のみを分画し、Illumina社Hiseq2000およびHiseq2500を用いてペアエンドシーケンスを行う。
3.次世代シーケンスデータ解析：次世代シーケンス算出データから遺伝子変異同定するための効率的な解析フローを策定、これを用いて解析データから疾患に関連する変異を特定する。
4.次世代シーケンスデータの検証：対象とする遺伝性疾患の想定発症モデルに沿って次世代シーケンスで検出した遺伝子異常、稀なSNP候補群を症例および家族構成員のゲノムDNAを用いて、サンガーシーケンス等で検証していく。
5.遺伝子変異と臨床病型・機能異常の検討：本研究で変異が明らかになった症例についての詳細な臨床情報を分析し、遺伝子変異が惹起する臨床病型を明らかにし変異が及ぼす機能的影響を検証する。
6.次世代データ解析プロトコール：オープンリソースあるいは有料リソースの解析ソフト（マッピングツール、アノテーションツール）を比較検討し効率的かつ効果的な解析系を確立する。
7. ゲノム研究倫理の検討：本研究に関連する倫理的課題を調査・整理する。

結果と考察

1. 症例集積と一般研究班との連携：専門医と各種ネットワーク等を通じて遺伝性難治疾患の集積を行う。質の高い症例群の集積により全エクソームデータから真の遺伝子異常を同定する確率は飛躍的に向上し、これが研究成功の重要な鍵となる。本事業の一般研究班や難治性疾患克服研究事業奨励研究分野の既存班と連携し、研究を進めた。
2. 全エクソーム解析：Agilent社のSureSelectのエクソーム濃縮キットを用いてヒトゲノム全遺伝子のエクソン領域のみを分画し、HiSeq2000とHiseq2500をそれぞれ1台ずつ用いてペアエンドシーケンスを進めた。
3. 次世代シーケンスデータ解析：次世代シーケンス産出データから遺伝子変異同定するソフトウェアとしてNovoalign-GATK-Annovarを用いた解析フローを主たるプラットフォームとして多サンプルでエクソーム解析を進めた。
4. 次世代シーケンスデータの検証：検出した塩基異常をPCR・キャピラリーシーケンスにて検証する。この検証過程が極めて重要でプロトコール作成へフィードバックされる。検出した変異について順次検証を進めている。
5. 遺伝子変異と臨床病型・機能異常の検討：変異を発見した症例毎の詳細な臨床情報を分析し、臨床病型を明らかにし、変異が惹起する機能的影響を実験系で検証した。本年度は新規の疾患責任遺伝子としてSENDA・ネマリンミオパチー・SEMD-JL1・難治性てんかんの遺伝子変異同定に成功した。
6. 次世代データ解析プロトコールの策定：各種検出プロトコールによるデータの比較検討と改良によって最適プロトコール作りを進めた。既に複数の疾患で遺伝子異常が明らかになった陽性コントロールデータ用いてNovoalign/GATKによるアラインメントとAnnovaを用いたアノテーションツールを組み合わせた理想的なフローが出来上がった。
7. ゲノム研究倫理の検討：本研究に関連する倫理的課題を調査・整理を進めた。
本研究は、所属施設IRBの承認を受け適切な倫理的配慮と手続きを得て行われた。

結論

メンデル遺伝性疾患を解析対象にした次世代シーケンス拠点として解析環境を整備し、エクソーム解析において複数の原因未解明の疾患において責任遺伝子を単離した。情報解析系でも大量解析系にの対応も可能と成りエクソーム解析拠点としての研究が順調に進行している。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-10
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201331005B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 遺伝性難治疾患の網羅的エクソーム解析拠点の構築
• 課題番号: H23-実用化（難病）-一般-005
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 松本 直通(横浜市立大学 医学研究科 環境分子科学教室)

研究分担者(所属機関)

• 池川志郎(理化学研究所統合生命医科学研究センター)
• 高橋篤(理化学研究所統合生命医科学研究センター)
• 福嶋義光(信州大学医学部遺伝医学予防医学講座)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康長寿社会実現のためのライフ・イノベーションプロジェクト 難病・がん等の疾患分野の医療の実用化研究（難病関係研究分野）
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究は、特に遺伝性難治疾患を対象に、網羅的全エクソーム解析により原因遺伝子を解明することを目的とする。次世代シーケンス解析は点変異から染色体微細欠失まであらゆるゲノム上の変化の検出が可能で、遺伝性難治疾患の解明が一気に進むと考えられる。

研究方法

1.症例集積と他の研究班との連携:骨系統疾患コンソーシアム・胎児骨系統疾患ネットワーク、臨床遺伝ネットワークなどを通じ症例を集積する。既に実績と定評のある専門家ネットワークを通じて正確な診断が成され、かつ詳細な臨床情報を得られる症例群を多数集積する。
2.全エクソーム解析：Agilent社のSureSelect等を用いてヒトゲノム全遺伝子のエクソン領域のみを分画し、Illumina社Hiseq2000およびHiseq2500を用いてペアエンドシーケンスを行う。
3.次世代シーケンスデータ解析：次世代シーケンス算出データから遺伝子変異同定するための効率的な解析フローを策定、これを用いて解析データから疾患に関連する変異を特定する。
4.次世代シーケンスデータの検証：対象とする遺伝性疾患の想定発症モデルに沿って次世代シーケンスで検出した遺伝子異常、稀なSNP候補群を症例および家族構成員のゲノムDNAを用いて、サンガーシーケンス等で検証していく。
5.遺伝子変異と臨床病型・機能異常の検討
本研究で変異が明らかになった症例についての詳細な臨床情報を分析し、遺伝子変異が惹起する臨床病型を明らかにし変異が及ぼす機能的影響を検証する。
6.次世代データ解析プロトコール
オープンリソースあるいは有料リソースの解析ソフト（マッピングツール、アノテーションツール）を比較検討し効率的かつ効果的な解析系を確立する。

結果と考察

1.症例の集積：症例集積は順調に進行し精神遅滞関連症候群1500例やてんかん関連症候群720例が蓄積した。一般班である長谷川班、岩本班、西野班やAicardi症候群・孔脳症・Coffin-Siris症候群・ATR-X症候群・Sotos症候群・運動過剰症候群・血管型Ehlers-Danlos症候群・Kabuki症候群・ゲノムコピー数異常などの難治性疾患奨励研究あるいはその流れをくむ研究グループから多数症例提供を受けた。
2.全エクソーム解析：HiSeq2000・Hiseq2500並びに96サンプルを処理するエクソームロボットを導入し、最大で月に200サンプル超のエクソーム解析が可能となりこれまでに3500例を超えるエクソーム解析が行われた。
3・4・5.次世代シーケンスデータ解析・検証・臨床病型との検討：常染色体劣性遺伝性脊髄小脳変性症（Am J Hum Genet, 2011）、びまん性大脳白質変性症（Am J Hum Genet, 2011）、Coffin-Siris症候群（Nat Genet, 2012）、常染色体劣性遺伝性体短幹症（J Med Genet, 2012）ミトコンドリア異常症（Hum Mut, 2013）、SENDA（Nat Genet, 2013）、SEMD-JL1（Am J Hum Genet, 2013）、ネマリンミオパチー（Am J Hum Genet, 2013）、難治性てんかん（Ann Neurolo, 2012; Am J Hum Genet, 2013）などの新規責任遺伝子同定を行った。情報解析は、変異検出感度の高いインフォーマティクスフローを確立、エクソームデータ解析からバリアント候補の一覧化を効率よく進めることが可能であった。

結論

メンデル遺伝性疾患を解析対象にした次世代シーケンス拠点として解析環境を整備し、エクソーム解析において複数の原因未解明の疾患において責任遺伝子を単離した。情報解析系でも大量解析系にの対応も可能と成りエクソーム解析拠点としての研究が順調に進行している。

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-10
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201331005C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 全エクソーム解析を用いて原因未解明の遺伝性疾患の原因特定を行う効率的なシステムを構築することが出来た。全エクソーム解析拠点として全国の多様な小児遺伝性疾患を中心に検体を集積し3500例を超える解析を終了、16個の遺伝性疾患の遺伝的原因解明を行うことが可能であった。次世代シーケンス5拠点の1つとして1208名の正常日本人データベース（Human Genetic Variation Browser, HGVB）の作成のため429例の全エクソームデータを供与した。
• 臨床的観点からの成果: 常染色体劣性遺伝性脊髄小脳変性症（2011）、びまん性大脳白質変性症（2011）、Coffin-Siris症候群（2012）、常染色体劣性遺伝性体短幹症（2012）ミトコンドリア異常症（2013）、SENDA（2013）、SEMD-JL1（2013）、ネマリンミオパチー（2013）、難治性てんかん（2012, 2013）などの新規責任遺伝子同定を行い、遺伝子診断による確定診断を可能にした。
• ガイドライン等の開発: 次世代シーケンス5拠点班で日本人genetic variation databaseとしてHGVB（http://www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/index.html）の作成に貢献した。
• その他行政的観点からの成果: 因不明の遺伝性疾患の原因解明において全エクソーム解析の有用性を明らかにしてきた。特に小児神経分野では効果的であり全国および諸外国からの共同研究・解析依頼を積極的に受けこれまで原因不明であった様々な疾患の原因解明を行い、この領域を牽引している。
• その他のインパクト: 日本における希少疾患原因解明の拠点として質・量ともに機能し、多数の遺伝性疾患の原因解明や原因不明の症例の解決を行い、共同研究拠点として機能している。諸外国に先駆けて原因解明を行った疾患も数多い。成果が各種Webサイトあるいは新聞報道された疾患として、Coffin-Siris症候群、短体幹症、SENDA、SEMD-JL1、ネマリンミオパチー、難治性てんかん性脳症などである。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 77件
• その他論文(和文): 13件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 61件
• 学会発表(国際学会等): 7件
• その他成果(特許の出願): 9件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 1件

特許

• 特許の名称: Coffin-Siris症候群の新規遺伝子診断法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2013-252720 ; 発明者名: 鶴崎美徳/松本直通 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20131206 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ケトン血症を伴うリー脳症患者または保因者の検出法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2013-157339 ; 発明者名: 松本直通/三宅紀子 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20130731 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: 小児期のてんかんおよび不随意運動をきたす疾患の検出方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2013-123660 ; 発明者名: 才津浩智/松本直通 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20130612 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: ミトコンドリア複合体III欠乏症の確定診断法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2012-180356 ; 発明者名: 松本直通/三宅紀子 ; 権利者名: 横浜市立大学 ; 出願年月日: 20120816 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Tsurusaki Y, Okamoto N, Ohashi H, et al.; Mutations affecting components of the SWI/SNF complex cause Coffin-Siris syndrome.; Nat Genet , 44 (4) , 376-378 (2012)
• 原著論文2: Saitsu H, Kato M, Koide A, et al.; Whole exome sequenwcing identifies KCNQ2 mutations in Ohtahara syndrome.; Ann Neurol , 72 (2) , 298-300 (2012)
• 原著論文3: Miyake N, Elcioglu NH, Iida A, etal.; PAPSS2 mutations cause autosomal recessive brachyolmia.; J Med Genet , 49 (8) , 533-538 (2012)
• 原著論文4: Yoneda Y, Haginoya K, Kato M, et al.; Phenotype spectrum of COL4A1 mutations: porencephaly to schizencephaly. ; Ann Neurol , 73 (1) , 48-57 (2013)
• 原著論文5: Saitsu H, Osaka H, Sasaki M, et al.; Mutations in POLR3A and POLR3B encoding RNA polymerase III subunits cause an autosomal recessive hypomyelinating leukoencephalopathy. ; Am J Hum Genet , 89 (5) , 644-651 (2011)
• 原著論文6: Doi H, Yoshida K, T Yasuda, et al.; Exome sequencing reveals a homozygous SYT14 mutation in adult-onset autosomal recessive spinocerebellar ataxia with psychomotor retardation. ; Am J Hum Genet , 89 (2) , 320-327 (2011)
• 原著論文7: Yoneda Y, Haginoya K, Arai H, et al.; De novo and inherited mutations in the gene encoding a type IV collagen α2 chain (COL4A2) cause porencephaly.; Am J Hum Genet , 90 (1) , 86-90 (2012)
• 原著論文8: Miyatake S, Miyake N, Touho H, et al.; Homozygous c.14576G>A variant of RNF213 predicts early-onset and severe form of Moyamoya disease.; Neurology , 78 (11) , 803-810 (2012)
• 原著論文9: Miyake N, Mizuno S, Okamoto N, et al.; KDM6A point mutations cause Kabuki syndrome.; Hum Mut , 34 (1) , 108-110 (2013)
• 原著論文10: Miyake N, Yano S, Sakai C, et al.; Mitochondrial complex III deficiency caused by a homozygous UQCRC2 mutation presenting with neonatal-onset recurrent metabolic decompensation. ; Hum Mut , 34 (3) , 446-452 (2013)
• 原著論文11: Saitsu H, Nishimura T, Muramatsu K, et al. ; De novo mutations in the autophagy gene WDR45 cause static encephalopathy of childhood with neurodegeneration in adulthood.; Nat Genet , 45 (4) , 445-449 (2013)
• 原著論文12: Nakamura K, Kato M, Osaka H, et al.; Clinical spectrum of SCN2A mutations expanding to Ohtahara syndrome.; Neurology , 81 (11) , 992-998 (2013)
• 原著論文13: Nakajima M, Mizumoto S, Miyake N, et al.; Mutations in B3GALT6, which encodes a glycosaminoglycan linker region enzyme, cause a spectrum of skeletal and connective tissue disorders. ; Am J Hum Genet , 92 (6) , 927-934 (2013)
• 原著論文14: Nishiguchi KM, Tearle RG, Liu Y, et al.; Whole genome sequencing in patients with retinitis pigmentosa reveals pathogenic DNA structural changes and NEK2 as a new disease gene. ; Proc Natl Acad Sci USA , 110 (40) , 16139-16144 (2013)
• 原著論文15: Ravenscroft G, Miyatake S, Lehtokari V-L, et al.; Mutations in KLHL40 are a frequent cause of severe autosomal-recessive nemaline myopathy.; Am J Hum Genet , 93 (1) , 6-18 (2013)
• 原著論文16: Nakamura K, Kodera H, Akita T, et al.; De novo mutations in GNAO1 encoding a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy. ; Am J Hum Genet , 93 (3) , 496-505 (2013)
• 原著論文17: Kodera H, Nakamura K, Osaka H, et al.; De novo mutations in SLC35A2 encoding a UDP-galactose transporter cause early-onset epileptic encephalopathy. ; Hum Mut , 34 (12) , 1708-1714 (2013)
• 原著論文18: Gupta VA, Ravenscroft G, Shaheen R, et al.; Identification of KLHL41 mutations implicates BTB-Kelch-mediated ubiquitination as an alternate pathway to myofibrillar disruption in nemaline myopathy.; Am J Hum Genet , 93 (6) , 1108-1117 (2013)
• 原著論文19: Koshimizu E, Miyatake S, Okamoto N, et al. ; Performance comparison of bench-top next generation sequencers using microdroplet PCR-based enrichment for effective targeted sequencing in aatients with autism spectrum disorder.; Plos One , 8 (9) , e74167- (2013)
• 原著論文20: Sakai H, Suzuki S, Mizuguchi T, et al.; Rapid detection of gene mutations responsible for non-syndromic aortic aneurysm and dissection using two different methods: resequencing microarray technology and next-generation sequencing. ; Hum Genet , 131 (4) , 591-599 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2019-05-27
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201331005Z