文献情報
文献番号
201327050A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒトノロウイルス培養細胞の探索と食品からのノロウイルス検出に関する研究
課題番号
H24-食品-若手-017
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
上間 匡(国立医薬品食品衛生研究所 食品衛生管理部)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安全確保推進研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
5,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ノロウイルス(NV)は、最も重要な食中毒原因物質の一つであり，平成１０年以降ウイルスによる食中毒事件数は増加傾向を示し，その対策の重要性は非常に大きくなっている。
しかし、NVには培養細胞や実験動物を利用した感染・増殖系が無いために、実際の感染性NVの検出や不活化、制御等に関する詳細は不明であり、感染・増殖系の確立が世界的に望まれている。
本研究は，NVのカプシド蛋白を持つ組換えFCVを作成し、NV感受性細胞の網羅的スクリーニングを行い、NVの感染・培養系の確立を目指すものである。組換えFCVは環境中での動態や感染時の細胞侵入などのウイルス性状が感染性NVに近似することが予想され、従来の代替ウイルスと比較してよりNVの実態に近い環境中動態や、ウイルス不活化方法について検証することが可能になり、NV食中毒リスク低減や、食品におけるウイルス規格基準の策定への貢献が期待できる。
しかし、NVには培養細胞や実験動物を利用した感染・増殖系が無いために、実際の感染性NVの検出や不活化、制御等に関する詳細は不明であり、感染・増殖系の確立が世界的に望まれている。
本研究は，NVのカプシド蛋白を持つ組換えFCVを作成し、NV感受性細胞の網羅的スクリーニングを行い、NVの感染・培養系の確立を目指すものである。組換えFCVは環境中での動態や感染時の細胞侵入などのウイルス性状が感染性NVに近似することが予想され、従来の代替ウイルスと比較してよりNVの実態に近い環境中動態や、ウイルス不活化方法について検証することが可能になり、NV食中毒リスク低減や、食品におけるウイルス規格基準の策定への貢献が期待できる。
研究方法
１）対象ウイルス
ネコカリシウイルスF９株と，国内分離株のF4株を選定し，RFK細胞培養上清より抽出したRNAを用いた。ヒトノロウイルスとして，ヒトノロウイルスGII/4遺伝子型が検出された糞便検体より抽出したRNAを用いた。
２）組換えFCVゲノムプラスミド
FCVおよびNVゲノムプラスミドのウイルスゲノム上流へEF-1aプロモータを導入した。
３）組換え NV再構築条件の検討
CRFK細胞へFCV組換えゲノムプラスミドをトランスフェクションし，組換えFCVの再構築を検討
４）ウイルス因子導入法の検討
ゲノムプラスミドを細胞へ導入する際に，ウイルスのゲノムおよびウイルス粒子複製に必要と思われるウイルス因子を，細胞へ導入する方法としてタンパク質トランスフェクション法を用いた。
５）非感受性細胞を用いたウイルス増殖法の検討
４）のタンパクトランスフェクション法をを用いて，非感受性細胞にFCVをタンパクとしてトランスフェクションし，RNAの増幅および感染価の上昇を検討した。
ネコカリシウイルスF９株と，国内分離株のF4株を選定し，RFK細胞培養上清より抽出したRNAを用いた。ヒトノロウイルスとして，ヒトノロウイルスGII/4遺伝子型が検出された糞便検体より抽出したRNAを用いた。
２）組換えFCVゲノムプラスミド
FCVおよびNVゲノムプラスミドのウイルスゲノム上流へEF-1aプロモータを導入した。
３）組換え NV再構築条件の検討
CRFK細胞へFCV組換えゲノムプラスミドをトランスフェクションし，組換えFCVの再構築を検討
４）ウイルス因子導入法の検討
ゲノムプラスミドを細胞へ導入する際に，ウイルスのゲノムおよびウイルス粒子複製に必要と思われるウイルス因子を，細胞へ導入する方法としてタンパク質トランスフェクション法を用いた。
５）非感受性細胞を用いたウイルス増殖法の検討
４）のタンパクトランスフェクション法をを用いて，非感受性細胞にFCVをタンパクとしてトランスフェクションし，RNAの増幅および感染価の上昇を検討した。
結果と考察
１）組換えウイルスゲノムプラスミドの作成
プロモーターにEF-1aを導入した組換えウイルスのゲノムプラスミドを作成した。ウイルス再構築に使用可能と思われるゲノムプラスミドはpEF1a/NVのみが作出に成功した。pEF1aNV-FCVはORF1領域に点変異が必発し，そのままではフレームシフトが起きると考えられた。またフレームシフトのないプラスミドは大腸菌を用いたクローニング法では作成出来なかった。ｐEF1a/FCVについては，PCRでゲノム全長を増幅できるものの，完全長のゲノムプラスミドは作成出来なかった。
FCVゲノムプラスミドに関しては，フルゲノムプラスミド作成途中の段階でORF1－ORF2ジャンクション領域を含む約3.7kbのプラスミドを作製し，これを食品等からのウイルス検査法でのリアル・タイムPCRの標準プラスミドとして使用できることを確認した。この標準プラスミドを利用して，感染性ウイルス粒子推定法の開発を行った。
２）組換えNVの再構築
残念ながら現在のところ組換えウイルスの再構築は確認できておらす，引き続き再構築条件の検討を行なっている状況である。ウイルス再構築のためには，ゲノムプラスミドのみならず，ウイルス因子の細胞への導入について検討する必要があると考えられた。
３）タンパク質トランスフェクション法の検討
ウイルス因子の導入法として，複数のタンパク質トランスフェクション試薬について検討を行った結果，遺伝子トランスフェクションでも効率が良いとされる293T細胞やHeLa細胞において，タンパク質トランスフェクションも効率が良いことが示唆された。
プロモーターにEF-1aを導入した組換えウイルスのゲノムプラスミドを作成した。ウイルス再構築に使用可能と思われるゲノムプラスミドはpEF1a/NVのみが作出に成功した。pEF1aNV-FCVはORF1領域に点変異が必発し，そのままではフレームシフトが起きると考えられた。またフレームシフトのないプラスミドは大腸菌を用いたクローニング法では作成出来なかった。ｐEF1a/FCVについては，PCRでゲノム全長を増幅できるものの，完全長のゲノムプラスミドは作成出来なかった。
FCVゲノムプラスミドに関しては，フルゲノムプラスミド作成途中の段階でORF1－ORF2ジャンクション領域を含む約3.7kbのプラスミドを作製し，これを食品等からのウイルス検査法でのリアル・タイムPCRの標準プラスミドとして使用できることを確認した。この標準プラスミドを利用して，感染性ウイルス粒子推定法の開発を行った。
２）組換えNVの再構築
残念ながら現在のところ組換えウイルスの再構築は確認できておらす，引き続き再構築条件の検討を行なっている状況である。ウイルス再構築のためには，ゲノムプラスミドのみならず，ウイルス因子の細胞への導入について検討する必要があると考えられた。
３）タンパク質トランスフェクション法の検討
ウイルス因子の導入法として，複数のタンパク質トランスフェクション試薬について検討を行った結果，遺伝子トランスフェクションでも効率が良いとされる293T細胞やHeLa細胞において，タンパク質トランスフェクションも効率が良いことが示唆された。
結論
・FCVおよびNV GII4のウイルスゲノムのクローニングを行ったが，現時点でFCVおよび NVのウイルスゲノムのクローニングは非常に困難であることが明らかになった。
・組換えウイルスのゲノムプラスミドの構築を行った。
・FCV ORF1（ポリメラーゼ）-ORF2（カプシド） 領域を含むプラスミドを作成し，感染性推定遺伝子検査法の開発等を行った。
・pEF1a/NV についてウイルスの再構築を試みたが，再構築には至らなかった。
・細胞へのウイルス因子導入法として，タンパク質トランスフェクション法を検討した。
・タンパク質トランスフェクション法により，FCVを非感受性細胞へ導入し，ゲノムRNAの増加，感染力価の上昇を確認した。
・タンパク質トランスフェクション法が，感受性細胞のないウイルスの増殖方法として利用できる可能性が示唆された。
・組換えウイルスのゲノムプラスミドの構築を行った。
・FCV ORF1（ポリメラーゼ）-ORF2（カプシド） 領域を含むプラスミドを作成し，感染性推定遺伝子検査法の開発等を行った。
・pEF1a/NV についてウイルスの再構築を試みたが，再構築には至らなかった。
・細胞へのウイルス因子導入法として，タンパク質トランスフェクション法を検討した。
・タンパク質トランスフェクション法により，FCVを非感受性細胞へ導入し，ゲノムRNAの増加，感染力価の上昇を確認した。
・タンパク質トランスフェクション法が，感受性細胞のないウイルスの増殖方法として利用できる可能性が示唆された。
公開日・更新日
公開日
2018-06-11
更新日
-