文献情報
文献番号
201327009A
報告書区分
総括
研究課題名
食品中の毒素産生微生物及び試験法に関する研究
課題番号
H23-食品-一般-011
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
鎌田 洋一(岩手大学 農学部)
研究分担者(所属機関)
- 西川 禎一(大阪市立大学大学院 生活科学研究科)
- 三宅 眞実(大阪府立大学大学院 応用生命科学研究科)
- 宇治家 武史(カイノス株式会社 開発研究所)
- 山本 茂貴(東海大学海洋水産学部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 食品の安全確保推進研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
8,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究では、食品の安全確保を推進するため、毒素産生性食中毒細菌のなかで、ブドウ球菌、およびセレウス菌が産生する嘔吐毒素、ならびにウエルシュ菌下痢毒素とそれら毒素産生性細菌について、食品中から直接検出する試験法を開発するとともに、各細菌の食品危害性に焦点をあてたリスクプロファイルを作製し、食品衛生行政における食中毒発生予防施策作製に貢献することを目的とする。さらには、それぞれの食中毒の発生機構を分子レベルで解析し、学術的な貢献を行うことを目的とする。
研究方法
セレウス菌が産生する嘔吐毒素（セレウリド）を検出する方法として、比較的安価な分析機器であるHPLCが適応できるかどうか検討した。
セレウリド産生性セレウス菌のみを特異的に検出する遺伝子検査法を開発した。セレウリド合成酵素遺伝子を含むcesオペロンを標的とした。Nucleic Acid Sequence-based Amplification（NASBA）・核酸クロマト法を採用し、セレウリド産生セレウス菌の迅速遺伝子検出法開発を検討した。
黄色ブドウ球菌のリスクプロファイル作成のため、国内外の疫学的情報（食中毒発生件数、原因食品、患者数等）、新たに得られた分子生物学的な情報（感染性、発症機序等）、新たな診断法、予防法、治療法、リスク評価（用量反応等）についてインターネットから情報を収集した。
ウエルシュ菌の腸管内挙動は全くの未解析のため、実験モデルを作製し検討をしてきた。胆汁酸の一種であるデオキシコール酸の芽胞形成および毒素産生への影響を検討した。
ウエルシュ菌食中毒は、エンテロトキシンと呼ばれる毒素によって症状発現すると説明されている。一方、一部のウエルシュ菌食中毒事例菌株が新型下痢毒素を産生することを明らかにしてきた。次世代シークエンサーを用いて事例菌株のゲノム解析を行った。
セレウリド産生性セレウス菌のみを特異的に検出する遺伝子検査法を開発した。セレウリド合成酵素遺伝子を含むcesオペロンを標的とした。Nucleic Acid Sequence-based Amplification（NASBA）・核酸クロマト法を採用し、セレウリド産生セレウス菌の迅速遺伝子検出法開発を検討した。
黄色ブドウ球菌のリスクプロファイル作成のため、国内外の疫学的情報（食中毒発生件数、原因食品、患者数等）、新たに得られた分子生物学的な情報（感染性、発症機序等）、新たな診断法、予防法、治療法、リスク評価（用量反応等）についてインターネットから情報を収集した。
ウエルシュ菌の腸管内挙動は全くの未解析のため、実験モデルを作製し検討をしてきた。胆汁酸の一種であるデオキシコール酸の芽胞形成および毒素産生への影響を検討した。
ウエルシュ菌食中毒は、エンテロトキシンと呼ばれる毒素によって症状発現すると説明されている。一方、一部のウエルシュ菌食中毒事例菌株が新型下痢毒素を産生することを明らかにしてきた。次世代シークエンサーを用いて事例菌株のゲノム解析を行った。
結果と考察
HPLCで測定するとセレウリドに明瞭なピークを認めた。一方、同ピークを質量分析器／液体クロマトグラフィーシステムで分析すると、合成セレウリドのピークと一致しなかった。バイオアッセイでセレウリドの存在を確認した検体では同ピークが検出され、陰性検体には同ピークは認められなかった。
NASBA・核酸クロマト法に最適化させたプライマーやプローブを用い、標的核酸の合成RNA（10コピー）を僅か10分の増幅時間で検出する能力を持つキットを開発した。米飯やチャーハンを含む5種の食品への菌接種試験の結果、104 cfu/gの感度でセレウリド産生セレウス菌を検出した。この感度は、セレウス菌食中毒の発症菌量よりも10倍高かった。
黄色ブドウ球菌についてリスクプロファイルを作製した。黄色ブドウ球菌は菌が産生する耐熱性のエンテロトキシンによって中毒症状を発現させる。エンテロトキシンは菌増殖に伴って産生される。毒素は耐熱性を持つため、加熱加工食品中においても毒性を保持している。
ウエルシュ菌の芽胞形成と毒素産生について、生体内成分であるデオキシコール酸がウエルシュ菌芽胞形成のマスター・レギュレーターであるSpo0Aタンパクに直接、あるいは間接的にその上流に作用した結果、芽胞形成とそれに続く毒素産生を強く誘導していることを明らかした。
新型エンテロトキシン産生性ウエルシュ菌事例株のゲノム解析を行い、約3 Mbpの染色体と、2種類のプラスミドが存在することを明らかにした。
NASBA・核酸クロマト法に最適化させたプライマーやプローブを用い、標的核酸の合成RNA（10コピー）を僅か10分の増幅時間で検出する能力を持つキットを開発した。米飯やチャーハンを含む5種の食品への菌接種試験の結果、104 cfu/gの感度でセレウリド産生セレウス菌を検出した。この感度は、セレウス菌食中毒の発症菌量よりも10倍高かった。
黄色ブドウ球菌についてリスクプロファイルを作製した。黄色ブドウ球菌は菌が産生する耐熱性のエンテロトキシンによって中毒症状を発現させる。エンテロトキシンは菌増殖に伴って産生される。毒素は耐熱性を持つため、加熱加工食品中においても毒性を保持している。
ウエルシュ菌の芽胞形成と毒素産生について、生体内成分であるデオキシコール酸がウエルシュ菌芽胞形成のマスター・レギュレーターであるSpo0Aタンパクに直接、あるいは間接的にその上流に作用した結果、芽胞形成とそれに続く毒素産生を強く誘導していることを明らかした。
新型エンテロトキシン産生性ウエルシュ菌事例株のゲノム解析を行い、約3 Mbpの染色体と、2種類のプラスミドが存在することを明らかにした。
結論
HPLCによるセレウリド検出については、ピークそのものではないが、セレウリド産生と同調して産生される物質について、安価なHPLCで検出できることを示している。
セレウリド産生セレウス菌の遺伝子検査法として核酸クロマト法を開発した。本検出法は市場投入され、平成25年8月1日より市販された。
黄色ブドウ球菌のリスクプロファイルを作製した。菌が食品内で増殖中に耐熱性毒素を産生し、食品加工過程を経ても毒素が失活しないため食中毒が発生する。菌増殖を制御することの有用性と、加工食品中のエンテロトキシンを検出する重要性が認識された。
腸管内でのウエルシュ菌の増殖・芽胞形成・毒素産生について、胆汁酸に分類される一部の生体成分が、ウエルシュ菌の芽胞形成と毒素産生を強く誘導していることを明らかにした。ウエルシュ菌食中毒は毒素によって症状が発現するため、生体成分が引き金になり毒素産生に至ることを明らかにした本知見は、ウエルシュ菌食中毒発生機構を考える上で有意義なものと考えられた。
新型エンテロトキシン遺伝子は、事例菌が持つプラスミド中に存在することが明らかになった。同プラスミド中の遺伝子は毒素を除いて未知のものがほとんどで、プラスミドの解析により、ウエルシュ菌属での、新型毒素遺伝子の伝播様式が明らかになることが示唆された。
セレウリド産生セレウス菌の遺伝子検査法として核酸クロマト法を開発した。本検出法は市場投入され、平成25年8月1日より市販された。
黄色ブドウ球菌のリスクプロファイルを作製した。菌が食品内で増殖中に耐熱性毒素を産生し、食品加工過程を経ても毒素が失活しないため食中毒が発生する。菌増殖を制御することの有用性と、加工食品中のエンテロトキシンを検出する重要性が認識された。
腸管内でのウエルシュ菌の増殖・芽胞形成・毒素産生について、胆汁酸に分類される一部の生体成分が、ウエルシュ菌の芽胞形成と毒素産生を強く誘導していることを明らかにした。ウエルシュ菌食中毒は毒素によって症状が発現するため、生体成分が引き金になり毒素産生に至ることを明らかにした本知見は、ウエルシュ菌食中毒発生機構を考える上で有意義なものと考えられた。
新型エンテロトキシン遺伝子は、事例菌が持つプラスミド中に存在することが明らかになった。同プラスミド中の遺伝子は毒素を除いて未知のものがほとんどで、プラスミドの解析により、ウエルシュ菌属での、新型毒素遺伝子の伝播様式が明らかになることが示唆された。
公開日・更新日
公開日
2018-06-14
更新日
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