文献情報
文献番号
201321016A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト／チンパンジー・マウスハイブリッド技術を利用したＢ型肝炎ウイルス感染モデルマウスの開発
課題番号
H24-Ｂ創-肝炎-一般-017
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
山村 研一(熊本大学 生命資源研究・支援センター)
研究分担者(所属機関)
- 荒木 喜美（山本 喜美）(熊本大学 生命資源研究・支援センター)
- 江良 択実(熊本大学 発生医学研究所)
- 佐々木 裕(熊本大学 生命科学研究部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 B型肝炎創薬実用化等研究経費
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成28(2016)年度
研究費
76,924,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
B型肝炎は治療抵抗性であるとともに10-20%に肝癌が発症することから、新たな治療法の確立は急務である。そこで、HBV感染可能でヒトと同様の免疫応答を行うマウスモデルを作製し、病態解析と非臨床試験に使用可能な画期的なツールを開発することを目的とする。
研究方法
１．チンパンジー肝臓キメラマウスの作製
１）HLA-A2.1(hα1-hα2-mα3)-hβ2m (HHDと略)を導入したciPSの樹立。入手したHHDを、ciPSに導入する
２）Tg(HDD);H2-DB-/-;B2m-/-からのES細胞の樹立
２．ヒト肝臓置換マウスの作製
１）HHDを導入したヒトiPS細胞の樹立（hiPS: HDD）
HBVの抗原提示をヒト肝細胞で行わせるためHDDをhiPSにも導入する。
２）ES:HHD;H2-DB-/-;B2m-/-;SCCDの樹立
Tg(HHD);H2-DB-/-;B2m-/-から樹立したES細胞に、SAP-Cre-ERT2(SD)およびCAG-loxP-EGFP-loxP-DT-A(CD)を導入したES細胞（ES：HHD;H2-DB-/-;B2m-/-;SCCD）を樹立する。
１）HLA-A2.1(hα1-hα2-mα3)-hβ2m (HHDと略)を導入したciPSの樹立。入手したHHDを、ciPSに導入する
２）Tg(HDD);H2-DB-/-;B2m-/-からのES細胞の樹立
２．ヒト肝臓置換マウスの作製
１）HHDを導入したヒトiPS細胞の樹立（hiPS: HDD）
HBVの抗原提示をヒト肝細胞で行わせるためHDDをhiPSにも導入する。
２）ES:HHD;H2-DB-/-;B2m-/-;SCCDの樹立
Tg(HHD);H2-DB-/-;B2m-/-から樹立したES細胞に、SAP-Cre-ERT2(SD)およびCAG-loxP-EGFP-loxP-DT-A(CD)を導入したES細胞（ES：HHD;H2-DB-/-;B2m-/-;SCCD）を樹立する。
結果と考察
＜結果＞HBV感染可能で、かつヒトと同様の免疫応答によりB型肝炎を発症するマウスモデルの開発を目的とし、(1)チンパンジー肝臓キメラマウス(CM)の作製、(2) ヒト肝臓置換マウス(HM)の作製、(3)HBV肝炎モデルの確立を行う。このため、マウスのH-2 class Iを欠損し、代わりにヒトのMHC class Iを持つマウス系統を基本となるレシピエントマウスとし、このマウスからES細胞を樹立した。
(1)については、チンパンジーの血液細胞からのiPS細胞の樹立に成功し、幹細胞マーカーが発現し、染色体も正常で、３胚葉系への細胞に分化する能力もあることを明らかにした。肝臓欠失マウスを作製するためHhex遺伝子を破壊したES細胞(ES HHB:Hhex-/-)の樹立に成功した。マウスの肝細胞を完全に死滅させるため、２つのベクター、SAP-Cre-ERT2(SC)およびCAG-loxP-EGFP-loxP-DT-A(CD)を導入したHHB:SCCDマウスを樹立し、タモキシフェン投与でマウス肝細胞障害が起こること、投与量によって障害の程度を任意に調節できることを明らかにした。
(2)については、ヒトiPS細胞から約２週間程度で肝細胞へ分化誘導させる方法を開発することに成功した。また、移植するヒト肝細胞への拒絶反応を回避するため、マウス16.5日目ごろの胎児の卵黄嚢血管を通して移植する方法を確立した。
(3)については、CMやHMにHBVを感染させることを想定し、B型肝炎ウイルス抗原、抗体などの各種血清学的検査、および炎症マーカーの測定法を確立した。
＜考察＞ciPS：樹立したチンパンジー由来iPS細胞は、本研究の全体目標の１つであるチンパンジー由来の肝臓をもつキメラマウスの作製へ活用する。
HHBマウスからES HHBの樹立に成功した。本マウス系統は、免疫系のうちクラスIがヒトとなっている。これを用いて、以下に記したマウス系統の樹立に使用する。
HHB:SCCD：タモキシフェン投与により肝障害が起こることを確認し、本マウス系統がヒト肝細胞の移植に使用できることが明らかになった。このマウス系統を用いて、胎児卵黄嚢血管経由でヒト肝細胞を移植し、ヒト化肝臓マウスを作製し、HBVの感染実験を行う予定である。また、今後ヒトB型肝炎患者からのiPSから分化誘導した肝細胞を用いて肝臓ヒト化マウスも作製できると思われ、B型肝炎の発症機構や肝癌発生機構等の解明に用いることができると思われる。
ES HHB:Hhex-/-：このES細胞を用いて、マウス系統（HHB:Hhex-/-）を樹立し、ciPSとのキメラ作製に用いる予定である。上記のHHB:SCCDと交配し、HHB:Hhex-/-;SCCDを作製するために用いる。
HHB:Hhex-/-;SCCD：HBV感染、肝炎発症、慢性化等を確認できれば、治療薬検定の画期的なツールになると予想され、治療薬を開発しているグループへの供給を行う。
(1)については、チンパンジーの血液細胞からのiPS細胞の樹立に成功し、幹細胞マーカーが発現し、染色体も正常で、３胚葉系への細胞に分化する能力もあることを明らかにした。肝臓欠失マウスを作製するためHhex遺伝子を破壊したES細胞(ES HHB:Hhex-/-)の樹立に成功した。マウスの肝細胞を完全に死滅させるため、２つのベクター、SAP-Cre-ERT2(SC)およびCAG-loxP-EGFP-loxP-DT-A(CD)を導入したHHB:SCCDマウスを樹立し、タモキシフェン投与でマウス肝細胞障害が起こること、投与量によって障害の程度を任意に調節できることを明らかにした。
(2)については、ヒトiPS細胞から約２週間程度で肝細胞へ分化誘導させる方法を開発することに成功した。また、移植するヒト肝細胞への拒絶反応を回避するため、マウス16.5日目ごろの胎児の卵黄嚢血管を通して移植する方法を確立した。
(3)については、CMやHMにHBVを感染させることを想定し、B型肝炎ウイルス抗原、抗体などの各種血清学的検査、および炎症マーカーの測定法を確立した。
＜考察＞ciPS：樹立したチンパンジー由来iPS細胞は、本研究の全体目標の１つであるチンパンジー由来の肝臓をもつキメラマウスの作製へ活用する。
HHBマウスからES HHBの樹立に成功した。本マウス系統は、免疫系のうちクラスIがヒトとなっている。これを用いて、以下に記したマウス系統の樹立に使用する。
HHB:SCCD：タモキシフェン投与により肝障害が起こることを確認し、本マウス系統がヒト肝細胞の移植に使用できることが明らかになった。このマウス系統を用いて、胎児卵黄嚢血管経由でヒト肝細胞を移植し、ヒト化肝臓マウスを作製し、HBVの感染実験を行う予定である。また、今後ヒトB型肝炎患者からのiPSから分化誘導した肝細胞を用いて肝臓ヒト化マウスも作製できると思われ、B型肝炎の発症機構や肝癌発生機構等の解明に用いることができると思われる。
ES HHB:Hhex-/-：このES細胞を用いて、マウス系統（HHB:Hhex-/-）を樹立し、ciPSとのキメラ作製に用いる予定である。上記のHHB:SCCDと交配し、HHB:Hhex-/-;SCCDを作製するために用いる。
HHB:Hhex-/-;SCCD：HBV感染、肝炎発症、慢性化等を確認できれば、治療薬検定の画期的なツールになると予想され、治療薬を開発しているグループへの供給を行う。
結論
キメラマウスを用いてHBV感染に必要な目安となるマウス系統は得られた。今後キメラマウスが完成すれば実際にキメラマウスに対するHBV感染実験を行うが、用いるHBV株は速やかに研究を進めるため、患者プロファイルおよびゲノム情報の解析が進んでいる株を用いる。
公開日・更新日
公開日
2015-06-03
更新日
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