エクソン５３を標的としたデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するエクソン・スキップ治療薬の開発

文献情報

• 文献番号: 201317078A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: エクソン５３を標的としたデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するエクソン・スキップ治療薬の開発
• 課題番号: H23-神経-筋-一般-005
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 伸一(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部)

研究分担者(所属機関)

• 永田　哲也(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所)
• 岡田　尚巳(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所)
• 小牧　宏文(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　病院)
• 木村　円(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　トランスレーショナル・メディカルセンター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 19,548,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）に対する治療法として、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（AO）を用いたエクソン・スキップ治療薬の開発が進行している。特にエクソン51スキップ治療薬の開発が先行しているが、DMD患者の遺伝子変異形式は多様なため、その対象患者の割合は全体の13％に留まる。我々はこのような状況を鑑み、次いで対象患者数が多いエクソンの一つとされるエクソン53を対象とした、同様の機序による治療薬の開発に着手した。企業との共同研究を経て有効なモルフォリノAO配列を決定し、国産初のアンチセンス医薬品としての承認を得るべく、平成25年の医師主導治験開始を目標に開発を進めてきたところである。本研究は平成23年度に採択され、最終年度となる平成25年度は、これまでの非臨床試験の実施経過の総括、被験者組み入れ及び有効性評価等に係る技術的検討、並びにエクソン・スキップの応用拡大を目指した探索的研究について実施した

研究方法

(1)これまでの非臨床試験の実施経過についての検討
本研究の実施施設である国立精神・神経医療研究センター病院、同トランスレーショナル・メディカルセンター、及び同神経研究所に所属する担当者、並びに共同開発企業の担当者からなる作業部会において検討を行った。
(2)臨床試験におけるスクリーニング及び有効性評価方法等に係る検討
被験者由来線維芽細胞に筋分化を誘導し、治験薬を導入してエクソン・スキップの有無と短縮ジストロフィンの発現について評価した。また正常、DMD及びBMD患者由来の生検骨格筋検体を用いてジストロフィン／スペクトリン二重蛍光免疫染色を行い、それぞれの蛍光強度を定量した。
(3)エクソン・スキップの探索的技術開発に係る検討
エクソン45－55を欠いた短縮ジストロフィンのみが全身で発現するトランスジェニックマウスを作出し、その表現形・筋機能について解析を行った。メロシン欠損型先天性筋ジストロフィーモデルであるMDC1Aマウスに対し、LAMA2遺伝子変異をインフレームに誘導するモルフォリノAOを投与して解析を行った。

結果と考察

(1)検討の結果、DMDに対する治療薬開発は希少疾患であること、臨床的有効性の検証方法が確立されていないこと、また核酸医薬品自体も比較的新規性の高い医薬品であることから、安全性・品質を適切に検証する方法に不確実性が存在することが改めて認識された。本開発プロジェクトでは当初スケジュールのとおり 平成25年に臨床試験開始に至ったが、これは薬事戦略相談制度を活用した当局との対話により、上記の課題に適切に対処し、開発計画の進捗管理に反映させたことが一因と考えられた。
(2)in vitroアッセイの結果、組み入れ予定被験者細胞に治験薬を暴露したところ、エクソン53スキップと短縮ジストロフィンの発現が全例で認められた。新規エクソン・スキップ治療薬開発に際しての、被験者の適格性評価、及び治験薬の事前有効性評価において、本アッセイは有用と考えられた。また正常、DMD及びBMD患者由来の骨格筋検体間で定量したジストロフィンの蛍光強度は、目視で認められる強度と相関し、臨床試験で採取される検体に適用することの妥当性が示唆された。
(3)エクソン45-55を欠失した短縮ジストロフィンは全長ジストロフィンとほぼ同等の機能を有していた。またこの短縮形ジストロフィンはトランスジェニックマウスにおいて細胞内Ca濃度の上昇を促しfiber type構成比の変化を誘導していた。AOを投与されたMDC1Aマウスでは、標的エクソンのスキップとメロシンの部分的な回復が認められ、有意ではないものの生存期間の延長による症状改善傾向が認められた。

結論

本課題ではエクソン53スキップ治療薬の実用化を目指し、医師主導による早期探索的臨床試験開始に向けた技術的課題の検討を行って来たが、非臨床試験の実施や臨床試験プロトコールの作成などが順調に推移し、平成25年に治験計画届出を行い、当該臨床試験を開始した（UMIN CTR: 000010964, ClinicalTrials.gov: NCT02081625）。実施最終年度に治験を開始できたことから、所期の目的はおおむね達成されたと考えられる。また個別の被験者における適格性評価、及び治験薬の事前有効性評価において、in vitroによるスクリーニングは有用であった。治験薬投与後のジストロフィン発現の定量的評価に際しても、二重蛍光免疫染色法を適用できる目途が立った。エクソン45－55スキップによる短縮ジストロフィンの機能解明、及びMDC1Aマウスに対するモルフォリノの応用など、エクソン・スキップの今後の展開に繋がる学術的な成果も得られた。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201317078B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: エクソン５３を標的としたデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対するエクソン・スキップ治療薬の開発
• 課題番号: H23-神経-筋-一般-005
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 武田 伸一(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部)

研究分担者(所属機関)

• 永田　哲也(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所)
• 岡田　尚巳(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所)
• 小牧　宏文(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　病院)
• 木村　円(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　トランスレーショナル・メディカルセンター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）に対する治療法として、アンチセンス・オリゴヌクレオチド（AO）を用いたエクソン・スキップ治療薬の開発が進行している。特にエクソン51スキップ治療薬の開発が先行しているが、DMD患者の遺伝子変異形式は多様なため、その対象患者の割合は全体の13％に留まる。我々はこのような状況を鑑み、次いで対象患者数が多いエクソンの一つとされるエクソン53を対象とした、同様の機序による治療薬の開発に着手した。企業との共同研究を経て有効なモルフォリノAO配列を決定し、国産初のアンチセンス医薬品としての承認を得るべく、平成25年の医師主導治験開始を目標に開発を進めてきたところである。本研究課題は平成23年度に採択され、同治療薬開発に係る非臨床試験の実施、被験者組み入れ及び有効性評価等に係る技術的課題の検討、並びにエクソン・スキップの応用拡大を目指した探索的研究等を目的として実施された。

研究方法

(1)エクソン53スキップ治療薬の非臨床試験に係る検討
これまでに得られた当該治験薬のデータ、組み入れ可能な被験者数、及び類薬の試験結果等を参考に、first-in-human試験の治験実施計画書骨子を作成し、本骨子を踏まえて必要とされる非臨床試験の内容を検討した。医薬品医療機器総合機構（PMDA）との薬事戦略相談を経て最終的な計画を確定し、薬理薬効試験、薬物動態試験及び毒性試験等を実施した。
(2)臨床試験におけるスクリーニング及び有効性評価方法等に係る検討
組み入れ可能な被験者数についての予測、被験者由来細胞を用いた事前有効性評価、及び投与後の有効性評価手法としての二重蛍光免疫染色手法に関して検討を行った。必要に応じDMD患者由来細胞・組織等を用いた検証を行った。
(3)エクソン・スキップの探索的技術開発に係る検討
より高度なエクソン・スキップ手法の確立を目指し、GFPベクターを用いたAO配列スクリーニング系の開発、適用可能な変異パターンの増加と臨床的な改善が期待されるエクソン45－55スキップに関する研究、モルフォリノAOの取り込み機構解明を通した適応疾患の拡大に関する研究などについて、ヒト細胞及びモデルマウス等を用いた検討を行った。

結果と考察

(1)非臨床試験の計画段階において、モルフォリノの新規性、及び希少疾患が対象となる特殊性を踏まえ、PMDAとの対面助言が重要と考えられた。薬事戦略相談において非臨床試験計画についての綿密な議論を重ね、最終的な非臨床試験内容を確定した。以降の非臨床試験の進捗が順調に推移したことにより、臨床試験プロトコール作成においても支障をきたすことなく開発スケジュールは進行し、予定どおり平成25年に早期探索的臨床試験の開始に至った。
(2)エクソン53スキップの対象となる患者割合は、当施設に受診歴のあるDMD患者の9～10％と見込まれた。組み入れ可能な被験者が限定されることを考慮し、被験者の適格性及び治験薬の有効性を、患者由来細胞を用いてin vitroでスクリーニングする手法を開発し、これを組み入れ予定被験者全例に実施した。その結果、上記の適格性及び有効性が全例で確認できた。また生検骨格筋のジストロフィン二重蛍光免疫染色による有効性評価が適用可能であることが示唆された。
(3) GFPベクターを用いたスクリーニング法によりAOの可視的な有効性評価が可能となり、効果的配列探索の迅速化が期待された。エクソン45－55マルチスキップに係る手法、及び同手法により発現する短縮ジストロフィンの詳細な機能について、モデルマウス等を用いた解析を行い、症状の改善と筋病理学的な変化について報告した。またモルフォリノの取り込み機構と筋再生の関係を明らかにし、多くの筋疾患にAOが応用可能であることを報告した。

結論

本課題ではエクソン53スキップ治療薬の実用化を目指し、医師主導による早期探索的臨床試験開始に向けた技術的課題の検討を行って来たが、上記の成果に基づき平成25年に治験計画届出を行い、当該臨床試験を開始した（UMIN CTR: 000010964, ClinicalTrials.gov: NCT02081625）。実施最終年度に治験を開始できたことから、所期の目的はおおむね達成されたと考えられる。また本治験薬の開発過程から得られた新たな知見や、エクソン・スキップ治療薬の今後の展開に繋がる学術的成果も多く、今後は臨床試験の進捗に伴い生じると予想される、新たな技術的課題に取り組むための体制構築が必要と考えられる。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201317078C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）に対する根本療法としてエクソン53スキップを誘導するモルフォリノ核酸治療薬の開発を推進した。本治療薬に係る非臨床試験の実施、有効性評価に係る技術的な課題の検討、及び高度なエクソン・スキップ手法の確立を目指した基盤的な研究を実施し、本治療薬の早期探索的臨床試験の開始につながる重要な成果、並びに同手法の今後の展開につながる学術的な成果を得ることができた。
• 臨床的観点からの成果: エクソン53スキップ治療薬の実用化を目指したfirst-in-human試験として、医師主導による早期探索的臨床試験開始に向けた技術的課題の検討を行ってきたが、本研究で得られた成果に基づき平成25年に治験計画届出を行い、当該臨床試験を開始した（UMIN CTR: 000010964, ClinicalTrials.gov: NCT02081625）。国産のエクソン・スキップ医薬品の治験としては国内初であり、平成26年度末までに全ての被験者への投与を完了した。
• ガイドライン等の開発: 本治療薬は核酸医薬品に由来する新規性、及び対象疾患が希少疾患であるDMDという特殊性より、従来の医薬品開発にない困難さを有する。これらの課題に取り組む過程で得た知見を学術集会、学術論文等で発表を進めており、特に医薬品医療機器総合機構の開催したPMDA薬事戦略フォーラム(H25.11.19)においては、本薬の開発における薬事戦略相談事業の意義について講演を行った。また第５回医薬品・医療機器薬事戦略懇談会（H27.3.27）においては薬事戦略相談の事例として本薬の開発が取り上げられた。
• その他行政的観点からの成果: 本研究では国立精神・神経医療研究センターが運営する筋ジストロフィー患者登録データベースRemudy、及び筋ジストロフィー臨床試験ネットワークMDCTNが活用され、また本研究で得られた知見がこれらに還元されることで、全体として難病対策の向上に資する成果が得られた。また、厚生科学審議会疾病対策部会第39回難病対策委員会においては、NCNPにおける難病医療の現況と課題として本薬の開発が取り上げられた（2015.5.26）。さらに、本治療薬（NS-065/NCNP-01）は、2015年10月 に厚労省の先駆け審査指定制度の対象品目に指定されるという大きな成果があった。
• その他のインパクト: 研究代表者らの取り組みは、筋ジストロフィー協会の全国及び地方大会、並びに国立精神・神経医療研究センターをはじめ各地で開催された市民公開講座等で繰り返し採り上げられた。また医師主導治験開始の発表（H25.5.9）については、日本経済新聞、ウォール・ストリート・ジャーナルをはじめとした主要各紙、また日経バイオテク等の専門誌において報道された。平成26年度末には被験者に対する投与完了についてのプレスリリースを行った（H27.3.23）。さらに、平成27年度末にはNS-065/NCNP-01の先駆け審査指定および次相（第Ⅰ／Ⅱ相）試験の開始についてのプレスリリースを行った（H28.2.12）。

発表件数

• 原著論文（和文）: 10件
• 原著論文（英文等）: 53件
• その他論文(和文): 2件
• その他論文(英文等): 2件
• 学会発表(国内学会): 78件
• 学会発表(国際学会等): 28件
• その他成果(特許の出願): 13件
• その他成果(特許の取得): 3件
• その他成果(施策への反映): 3件
• その他成果(普及・啓発活動): 112件

特許

• 特許の名称: アンチセンス核酸
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特開2014-054250 ; 発明者名: 武田伸一、永田哲也、渡辺直樹、佐藤洋平 ; 権利者名: 日本新薬株式会社、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター ; 出願年月日: 20130905

• 特許の名称: アンチセンス核酸
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特許5363655 ; 発明者名: 武田伸一、永田哲也、渡辺直樹、佐藤洋平 ; 権利者名: 日本新薬株式会社、独立行政法人国立精神・神経医療研究センター ; 出願年月日: 20110831 ; 取得年月日: 20130913

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Nitahara-Kasahara Y, Hayashita-Kinoh H, Chiyo T, et al.; Dystrophic mdx mice develop severe car-diac and respiratory dysfunction following genetic ablation of the anti-inflammatory cytokine IL-10; Hum Mol Genet (2014)
• 原著論文2: Takeuchi F, Yonemoto N,Nakamura H,; Prednisolone improves walking in Japanese Duchenne muscular dystrophy patients; J Neurol , 260 (19) , 3023-3029 (2013)
• 原著論文3: Aoki Y, Nagata T, Yokota T, et al.; Highly efficient in vivo delivery of PMO into regenerating myotubes and rescue in laminin-α2 chain-null congenital muscu-lar dystrophy mice; Hum Mol Genet , 22 (24) , 4914-4928 (2013)
• 原著論文4: Nakamura A, Kobayashi M, Kuraoka M, et al.; Initial Pulmonary Respiration Causes Massive Diaphragm Damage and Hy-per-CKemia in Duchenne Muscular Dys-trophy Dog; Sci Rep , 3 (2013)
• 原著論文5: Echigoya Y, Lee J, Rodrigues M, Nagata T, et al.; Mutation types and aging differently affect revertant fiber expansion in dystrophic mdx and mdx52 mice; PLoS One , 8 (7) (2013)
• 原著論文6: Rayavarapu S, Coley W, Cakir E, ; Identification of disease specific pathways using in vivo SILAC proteomics in dys-trophin deficient mdx mouse; Mol Cell Proteomics , 12 (5) , 1061-1073 (2013)
• 原著論文7: Nakamura H, Kimura E, Mori Yoshimura M, et al.; Characteristics of Japanese Duchenne and Becker muscular dystrophy patients in a novel Japanese national registry of mus-culardystrophy (Remudy); Orphanet J Rare Dis , 8 (1) (2013)
• 原著論文8: Saito T, Ishigaki K, Murakami T, et al.; Identification of a Duplication Breakpoint in the DMD Gene Using Array Compara-tive Genomic Hybridization; Journal of Tokyo Women's Medical Col-lege , 83 (1) , E20-E24 (2013)
• 原著論文9: Yokota T, Nakamura A, Nagata T, et al.; Extensive and prolonged restoration of dystrophin expression with vi-vo-morpholino-mediated multiple exon skipping in dystrophic dogs; Nucleic Acid Ther , 22 (5) , 306-315 (2012)
• 原著論文10: Aoki Y, Yokota T, Nagata T, Nakamura A, et al.; Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic anti-sense delivery; Proc Natl Acad Sci USA , 109 (34) , 13763-13768 (2012)
• 原著論文11: Nitahara-Kasahara Y, Hayashita-Kinoh H, Ohshima-Hosoyama S, et al.; Long-term engraftment of multipotent mesenchymal stromal cells that differenti-ate to form myogenic cells in dogs with Duchenne muscular dystrophy; Molecular Therapy , 20 (1) , 168-177 (2012)
• 原著論文12: Aoki Y, Nagata T, Takeda S; New Approach for Antisense Oligonucleo-tide-Mediated Exon Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy; International Journal of Advanced Computer Science , 16 (4) , 521-526 (2012)
• 原著論文13: Koo T, Okada T, Athanasopoulos T, et al.; Long-term functional adeno-associated virus-microdystrophin expression in the dystrophic CXMDj dog; J Gene Med , 13 (9) , 497-506 (2011)
• 原著論文14: Taniguchi-Ikeda M, Kobayashi K, Kana-gawa M, et al.; Pathogenic exon-trapping by SVA re-trotransposon and rescue in Fukuyama muscular dystrophy; Nature , 478 , 127-131 (2011)
• 原著論文15: Hoffman EP, Bronson A, Levin AA, et al.; Restoring dystrophin expression in du-chenne muscular dystrophy muscle pro-gress in exon skipping and stop codon read through; Am J Pathol , 179 (1) , 12-22 (2011)
• 原著論文16: Yamada T, Okaniwa N, Saneyoshi H, et al.; Synthesis of 2'-O-[2-(N-Methylcarbamoyl)ethyl]ribonucleosides Using Oxa-Michael reaction and chemical and biological properties of oli-gonucleotide derivatives incorporating these modified ribonucleosides; J Org Chem , 76 (9) , 3042-3053 (2011)
• 原著論文17: Pichavant C, Aartsma-Rus A, Clemens PR, et al.; Current status of pharmaceutical and ge-netic therapeutic approaches to treat DMD; Mol Ther , 19 (5) , 830-840 (2011)
• 原著論文18: Miyazaki D, Nakamura A,Fukushima K, et al.; Matrix metalloproteinase-2 ablation in dystrophin-deficient mdx muscles reduces angiogenesis resulting in impaired growth of regenerated muscle fibers; Hum Mol Genet , 20 (9) , 1787-1799 (2011)
• 原著論文19: Lu QL, Yokota T, Takeda S, et al.; The status of exon skipping as a therapeutic approach to duchenne muscular dystrophy; Mol Ther , 19 (1) , 9-15 (2011)
• 原著論文20: Yokota T, Hoffman E, Takeda S; Antisense oligo-mediated multiple exon skipping in a dog model of duchenne muscular dystrophy; Methods Mol Biol , 709 , 299-312 (2011)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-29
• 更新日: 2017-06-12

収支報告書

• 文献番号: 201317078Z
• 報告年月日: 2015年03月25日

収入

• (1)補助金交付額: 25,410,000円
• (2)補助金確定額: 25,410,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	8,179,090円
		人件費・謝金	7,607,703円
		旅費	0円
		その他	3,761,207円
	間接経費		5,862,000円
	合計		25,410,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2015-12-17
• 更新日: -