文献情報
文献番号
201313064A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト化抗ＣＤ２０抗体を細胞外ドメインとした新規キメラ抗原レセプター （ＣＡＲ） 遺伝子導入Ｔ細胞の作成と評価
課題番号
H24-３次がん-若手-004
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
寺倉 精太郎(名古屋大学 医学部附属病院)
研究分担者(所属機関)
- 村田 誠(名古屋大学 医学部附属病院)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
研究開始年度
平成24(2012)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
2,693,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究ではヒト化CD20抗体を細胞外ドメインとして用いたCARを作成・評価し前臨床試験までを行うことを目的とした。CD20低発現細胞株や臨床分離細胞を用いてCD20低発現の標的に対するCD20-CARの作用について検討する。さらにAffinity/avidityを変化させたときにCD28/CD27/4-1BBの細胞内ドメインの違いが及ぼす影響について、とくに抗原刺激後のT細胞の増殖・メモリー化に及ぼす影響についてin vivoで検討する。
CD20刺激後のサイトカイン分泌や細胞分裂能から最適なCARの構造を決定し、これを用いた臨床試験の準備を行う。分担研究者において既に稼働しているCell processing centerを用いて実際の患者から分離したT細胞を用いた細胞調整の試験を数例程度行い、GMP基準に則った細胞調整が可能であることを確認する。
CD20刺激後のサイトカイン分泌や細胞分裂能から最適なCARの構造を決定し、これを用いた臨床試験の準備を行う。分担研究者において既に稼働しているCell processing centerを用いて実際の患者から分離したT細胞を用いた細胞調整の試験を数例程度行い、GMP基準に則った細胞調整が可能であることを確認する。
研究方法
これまで用いてきたCD28細胞内ドメインに替えて4-1BB/CD27の細胞内ドメインを組み込んだプラスミド・ベクターを作成した。これまでと同様にレトロウイルス・ベクターを作成した。CARがCD20に結合した後、伝達されるシグナルを比較検討するため、Jurkat細胞株にreporter vectorを組み込んだものを作成した。これにより、より定量的にシグナル伝達を評価できるものと考えた。
CARの細胞外ドメインとなる抗体のaffinityとCARの有効性との関連は詳細には検討されていない。5種類のaffinityの異なるCD20抗体を用いてCARを作成した。これをT細胞に遺伝子導入し、CAR-Tの細胞傷害活性などのT細胞活性に及ぼす影響を検討する。また、細胞内ドメインのaffinityの組み合わせの違いによってT細胞機能にどのような影響が出るのか検討する。
CARの細胞外ドメインとなる抗体のaffinityとCARの有効性との関連は詳細には検討されていない。5種類のaffinityの異なるCD20抗体を用いてCARを作成した。これをT細胞に遺伝子導入し、CAR-Tの細胞傷害活性などのT細胞活性に及ぼす影響を検討する。また、細胞内ドメインのaffinityの組み合わせの違いによってT細胞機能にどのような影響が出るのか検討する。
結果と考察
結果
新規にヒト化抗CD20抗体を細胞外ドメインとして用いたCARを作成し、細胞表面上に発現するCD20の抗原量とCD20-CAR+ T細胞の反応しうる限界について検討した。新たに作成したCD20-CARを遺伝子導入したCD20-CAR+ T細胞はCD20特異的に標的細胞を認識・傷害した。この細胞を用いて様々な程度のCD20を発現するCEM細胞株群に対する細胞傷害活性を検討した。今回作成したCD20CAR-T細胞は標的細胞あたり約200分子のCD20を認識して傷害することが分かった。同様にしてCD20CAR-T細胞を活性化するために必要なCD20分子密度を検討した。CD20CAR-Tを活性化するために必要なCD20抗原は標的細胞あたり約2000分子程度であることが分かった。さらに、CD20低発現となり臨床的に抗CD20抗体療法に対して不応となった慢性リンパ性白血病患者から樹立された細胞株・臨床分離検体に対しても十分高い認識・細胞傷害活性を示した。
CD27細胞内ドメインを用いたCARをCD28 あるいは4-1BBの細胞内ドメインを用いたCARと比較して有用性を検討することを目的として、これまで用いてきたCD28細胞内ドメインに替えて、4-1BB/CD27細胞内ドメインに入れ替えたものを作成した。これらのプラスミド・ベクターを用いてレトロウイルス・ベクターを作成した。細胞内シグナルを詳細に検討するため、Reporter vectorを遺伝子導入したJurkat細胞にこれらのCD20-CARを遺伝子導入し、CD20刺激後に比較検討する系を樹立した。しかしながら、刺激後に蛍光は定量的に検討できなかった。ATCCから購入したSUPT1細胞を用いてみたが同様の結果であった。
考察
本研究の結果から、CARは標的抗原が細胞あたり200分子程度発現していれば、傷害活性を示すことが出来、また2000分子程度発現していれば抗原刺激によって分裂・増殖などの活性化を示すことが分かった。すなわち、抗体の認識しうる範囲よりも低発現の標的でも十分認識しうることが示され、腫瘍抗原の探索範囲をこれまでよりも低発現の範囲に広げることによって新たな腫瘍抗原が得られる可能性が考えられた。そのような新しい戦略によって比較的発現の低い腫瘍抗原をCARの標的抗原として同定出来れば、CARの臨床応用の可能性も高まることが期待される。
新規にヒト化抗CD20抗体を細胞外ドメインとして用いたCARを作成し、細胞表面上に発現するCD20の抗原量とCD20-CAR+ T細胞の反応しうる限界について検討した。新たに作成したCD20-CARを遺伝子導入したCD20-CAR+ T細胞はCD20特異的に標的細胞を認識・傷害した。この細胞を用いて様々な程度のCD20を発現するCEM細胞株群に対する細胞傷害活性を検討した。今回作成したCD20CAR-T細胞は標的細胞あたり約200分子のCD20を認識して傷害することが分かった。同様にしてCD20CAR-T細胞を活性化するために必要なCD20分子密度を検討した。CD20CAR-Tを活性化するために必要なCD20抗原は標的細胞あたり約2000分子程度であることが分かった。さらに、CD20低発現となり臨床的に抗CD20抗体療法に対して不応となった慢性リンパ性白血病患者から樹立された細胞株・臨床分離検体に対しても十分高い認識・細胞傷害活性を示した。
CD27細胞内ドメインを用いたCARをCD28 あるいは4-1BBの細胞内ドメインを用いたCARと比較して有用性を検討することを目的として、これまで用いてきたCD28細胞内ドメインに替えて、4-1BB/CD27細胞内ドメインに入れ替えたものを作成した。これらのプラスミド・ベクターを用いてレトロウイルス・ベクターを作成した。細胞内シグナルを詳細に検討するため、Reporter vectorを遺伝子導入したJurkat細胞にこれらのCD20-CARを遺伝子導入し、CD20刺激後に比較検討する系を樹立した。しかしながら、刺激後に蛍光は定量的に検討できなかった。ATCCから購入したSUPT1細胞を用いてみたが同様の結果であった。
考察
本研究の結果から、CARは標的抗原が細胞あたり200分子程度発現していれば、傷害活性を示すことが出来、また2000分子程度発現していれば抗原刺激によって分裂・増殖などの活性化を示すことが分かった。すなわち、抗体の認識しうる範囲よりも低発現の標的でも十分認識しうることが示され、腫瘍抗原の探索範囲をこれまでよりも低発現の範囲に広げることによって新たな腫瘍抗原が得られる可能性が考えられた。そのような新しい戦略によって比較的発現の低い腫瘍抗原をCARの標的抗原として同定出来れば、CARの臨床応用の可能性も高まることが期待される。
結論
新規CD20-CARを作成し、T細胞に遺伝子導入を行った。これらのCD20-CAR+ T細胞はCD20を特異的に認識・傷害した。これらの細胞を用いてCD20低発現細胞株・臨床分離検体に対する反応を検討した。極めて低発現の細胞株や臨床分離検体でも認識・傷害しうることがわかった。CARのこういった特性を生かして、低発現であるが腫瘍特異性の極めて高い標的抗原の探索という新しい戦略が考えられた。
公開日・更新日
公開日
2015-09-02
更新日
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