文献情報
文献番号
201313058A
報告書区分
総括
研究課題名
肺癌糖鎖標的マーカーの実用化に向けた定量的糖鎖構造変動解析システムの構築
課題番号
H23-３次がん-若手-002
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
植田 幸嗣(独立行政法人理化学研究所 統合生命医科学研究センター)
研究分担者(所属機関)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
3,693,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本邦において肺癌は部位別がん死亡率で第一位を占めており、肺癌の罹患数、死亡者数を減少させることが急務となっている。そのためには根治可能なより早い段階で肺癌、またはその前癌病変を発見できる診断技術の開発は重要な位置を占める。研究代表者はこれまで、血清による肺癌の早期診断を目指して様々なグライコプロテオーム解析技術を用い、早期肺癌において糖鎖構造に変化が認められる多数の糖鎖標的マーカー候補の同定を行ってきた。そこで本研究ではそれら全てのマーカー候補糖タンパク質上に付加されている糖鎖の癌性変化を高感度に定量化、統合することによって肺癌を「治療可能な段階で早期に発見すること」、さらには「症状が出る前でのリスクの把握を可能にすること」を目標とする。本年度は、平成24年度に開発したEnergy resolved oxonium ion monitoring technology (Erexim)法を使用して、上記既同定の肺癌糖鎖標的腫瘍マーカー候補分子に対してバイオマーカー検証試験を行い、以後の臨床試験に繋がる診断薬シーズを確定することを目的とする。
研究方法
87症例の血清サンプル各5 µlをImmobilized Trypsinで消化し、消化後のペプチドサンプルを4000QTRAPトリプル四重極型質量分析計(AB Sciex社)にてLC/MS/MS分析に供した。
第一四重極Q1チャネルには各種バイオマーカー標的糖鎖付加サイトを含んだ糖ペプチドの質量電荷比(m/z)を設定した。第三四重極Q3チャネルには7種類のオキソニウムイオンのm/zを設定し、Erexim曲線を描出した。質量分析によって得られたデータはMultiQuant version 2.02 (AB Sciex社)ソフトウェアを用いてプロセッシング、各MSクロマトグラムの面積値を求める定量解析を行った。昨年度に報告した原著論文（Anal Chem. 2012; 84 (22): 9655）に記載した手法通り、m/z = 138のオキソニウムイオンを使用して各糖鎖コンポーネントの定量を、その他のオキソニウムイオンのErexim曲線パターン解析から糖鎖構造の同定を実施した。今年度の研究で対象としたコアフコースの付加頻度解析については、検出された全糖ペプチドのMSクロマトグラム面積値合計のうち、コアフコシル化糖鎖が付加されたペプチドの面積値合計が占める割合を算出した。
第一四重極Q1チャネルには各種バイオマーカー標的糖鎖付加サイトを含んだ糖ペプチドの質量電荷比(m/z)を設定した。第三四重極Q3チャネルには7種類のオキソニウムイオンのm/zを設定し、Erexim曲線を描出した。質量分析によって得られたデータはMultiQuant version 2.02 (AB Sciex社)ソフトウェアを用いてプロセッシング、各MSクロマトグラムの面積値を求める定量解析を行った。昨年度に報告した原著論文（Anal Chem. 2012; 84 (22): 9655）に記載した手法通り、m/z = 138のオキソニウムイオンを使用して各糖鎖コンポーネントの定量を、その他のオキソニウムイオンのErexim曲線パターン解析から糖鎖構造の同定を実施した。今年度の研究で対象としたコアフコースの付加頻度解析については、検出された全糖ペプチドのMSクロマトグラム面積値合計のうち、コアフコシル化糖鎖が付加されたペプチドの面積値合計が占める割合を算出した。
結果と考察
Erexim法を使用して、肺癌患者血清中にてコアフコースの付加頻度が有意に亢進している糖タンパク質として過去に同定したHaptoglobin、Orosomucoid-1、CD163について、87症例から成る検証試験セットを用いて糖鎖構造変化を定量化した。その結果、Haptoglobinについては付加された2本の糖鎖ともにIII期以上の進行肺腺癌群で有意なタンパク質上フコシル化の亢進が検出された。Orosomucoid-1に関しては5 箇所の糖鎖付加部位について糖鎖構造の定量データが得られたものの、肺腺癌の早期診断に有効と考えられるフコシル化変動は確認できなかった。CD163上糖鎖については、II期以上の肺腺癌患者でコアフコース付加頻度の有意な亢進が観察され、かつ病期依存的な付加頻度上昇が認められた。
3年計画の最終年度である本年度までに、本研究開始時に予定していた（１）新規糖鎖構造変動高速定量技術の開発、および（２）それを使用した既同定の肺癌糖鎖標的腫瘍マーカー候補分子の多検体検証試験、の双方を完了することができた。さらに、本研究計画終了後に予定していた体外診断機器開発に向けたソフトウェア開発、質量分析計開発も民間企業と連携してすでに開始しており、Erexim法自体は抗体医薬品をはじめとするあらゆるバイオ医薬品の品質評価試験、開発支援受託事業として実用化と普及が進んでいる。以上の進捗状況から鑑みて、当初想定された成果以上の診断薬化研究としての進展と幅広い医薬分野への波及効果が得られたと言える。
3年計画の最終年度である本年度までに、本研究開始時に予定していた（１）新規糖鎖構造変動高速定量技術の開発、および（２）それを使用した既同定の肺癌糖鎖標的腫瘍マーカー候補分子の多検体検証試験、の双方を完了することができた。さらに、本研究計画終了後に予定していた体外診断機器開発に向けたソフトウェア開発、質量分析計開発も民間企業と連携してすでに開始しており、Erexim法自体は抗体医薬品をはじめとするあらゆるバイオ医薬品の品質評価試験、開発支援受託事業として実用化と普及が進んでいる。以上の進捗状況から鑑みて、当初想定された成果以上の診断薬化研究としての進展と幅広い医薬分野への波及効果が得られたと言える。
結論
新規肺腺癌早期診断マーカーとして決定したCD163タンパク質については、本研究開発での成果を活かしてErexim法を応用した質量分析診断技術による体外診断薬化を目指す。また、Erexim法は世界初のマルチサイト（複数の糖鎖付加部位）糖鎖構造一斉定量技術であるので、CD163以外にも検証試験を進める肺癌早期診断バイオマーカー候補から診断能の高いターゲットをできるだけ多く選出し、より高精度で多角的な肺癌の診断が可能な診断機器製造を目指す。最終的に非侵襲的で安価に行える血清診断にて初期肺癌の検出やリスク診断までもが可能になれば、肺癌による死亡率は劇的に改善されると期待できる。
公開日・更新日
公開日
2015-09-02
更新日
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