文献情報
文献番号
201313038A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒトATL及びHBZトランスジェニックATL発症マウスを用いた比較ゲノム解析によるATL発症機構の解析
課題番号
H23-3次がん-一般-008
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
森下 和広(宮崎大学 医学部)
研究分担者(所属機関)
- 安永 純一朗(京都大学 ウイルス研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第3次対がん総合戦略研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
7,616,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書(概要版)
研究目的
成人T細胞白血病(ATL)はHTLV-1感染より数十年を経て白血病化する難治性白血病であるが、ゲノム異常の蓄積が著しく、固形癌に近い複雑核型を示す。このためATLにおける白血病発症にはHTLV-1感染後に多くのゲノム異常、エピゲノム異常が蓄積し多因子による発症が考えられる。さらにHTLV-1ウイルスのHTLV-1 bZIP factor (HBZ) は全てのATL 細胞で発現し、ATL細胞におけるHBZのノックダウンは細胞増殖を抑制する。さらにはHBZトランスジェニックマウスがT細胞リンパ腫を発症することからHBZはATLの発がんに必須であると考えられる。本研究ではそこで我々はATL細胞およびHBZトランスジェニックマウスを用いて全ゲノム、エピゲノム解析を行い、発症の分子メカニズムを明らかにすることを目的としている。
研究方法
1. ATLにおけるゲノム異常の探索と発症関連遺伝子群の機能解析
1)網羅的メチル化解析
前年度に引き続き、Illuminaメチル化アレイ解析を詳細に検討し、ATL発症に関わる遺伝子群を単離する。またパイロット研究として、急性型ATL検体をHTLV-1+/1分画し、それぞれ2検体をエクソームシークエンス、RNAシークエンスを行い、点突然変異の検索並びにスプライス異常・融合遺伝子等の検討を行う。
2)白血病関連遺伝子群のin vitro、in vivo実験
これまで単離した遺伝子群の機能を明らかにするため複合的な実験を行う。NDRG2・PTENに関しては質量分析計による網羅的結合タンパク質群の単離を行い、PTENキナーゼの同定並びにPTENリン酸化機構の解明を進める。CADM1に関してはプロモーターアッセイを中心にATL細胞における遺伝子発現機構の解明を目指す。BCL11Bにおいては発現様式の検討と、TGマウスの作製、過剰発現細胞株の樹立と遺伝子発現解析等を進める。またNDRG2のATLにおける低発現機構の解明と、HTLV-1感染防御機構としての働きの検討を行う。
2. HBZ-Tgに発症するTリンパ腫におけるゲノム異常の探索
1) HBZ-Tg由来Tリンパ腫細胞における遺伝子変異の網羅的探索
HBZ-TgのTリンパ腫から樹立した細胞株を用いて、エクソーム解析を行った。
3) HBZによる発現プロファイル変化の解析
HBZによる宿主細胞での発現プロファイルの変化を、Affymetrix社のマイクロアレイを用いて包括的に比較解析した。HBZ-TG由来CD4+Tリンパ球 vs 野生型マウスCD4+Tリンパ球とHBZ-TG由来制御性Tリンパ球 vs 野生型マウス制御性Tリンパ球を比較した。
1)網羅的メチル化解析
前年度に引き続き、Illuminaメチル化アレイ解析を詳細に検討し、ATL発症に関わる遺伝子群を単離する。またパイロット研究として、急性型ATL検体をHTLV-1+/1分画し、それぞれ2検体をエクソームシークエンス、RNAシークエンスを行い、点突然変異の検索並びにスプライス異常・融合遺伝子等の検討を行う。
2)白血病関連遺伝子群のin vitro、in vivo実験
これまで単離した遺伝子群の機能を明らかにするため複合的な実験を行う。NDRG2・PTENに関しては質量分析計による網羅的結合タンパク質群の単離を行い、PTENキナーゼの同定並びにPTENリン酸化機構の解明を進める。CADM1に関してはプロモーターアッセイを中心にATL細胞における遺伝子発現機構の解明を目指す。BCL11Bにおいては発現様式の検討と、TGマウスの作製、過剰発現細胞株の樹立と遺伝子発現解析等を進める。またNDRG2のATLにおける低発現機構の解明と、HTLV-1感染防御機構としての働きの検討を行う。
2. HBZ-Tgに発症するTリンパ腫におけるゲノム異常の探索
1) HBZ-Tg由来Tリンパ腫細胞における遺伝子変異の網羅的探索
HBZ-TgのTリンパ腫から樹立した細胞株を用いて、エクソーム解析を行った。
3) HBZによる発現プロファイル変化の解析
HBZによる宿主細胞での発現プロファイルの変化を、Affymetrix社のマイクロアレイを用いて包括的に比較解析した。HBZ-TG由来CD4+Tリンパ球 vs 野生型マウスCD4+Tリンパ球とHBZ-TG由来制御性Tリンパ球 vs 野生型マウス制御性Tリンパ球を比較した。
結果と考察
1. ATLにおけるゲノム異常の探索と発症関連遺伝子群の機能解析
今回NDRG2の機能解析を行い、NDRG2をPTEN結合タンパク質として同定した。NDRG2はPP2A phosphataseをリクルートし、PTEN脱リン酸化状態に保ちPTENの有するphosphatase活性を活性化状態にする働きを同定した。ATLにおいてNDRG2は発現低下状態にあり、そのためPTENは恒常的にリン酸化状態を保ちPI3K/AKT情報伝達系が活性化状態となった。そのNDRG2低下の原因としてメチル化はHTLV-1Taxに依存しており、HTLV-1感染初期からのメチル化が示唆された。
2. HBZ-TGに発症するTリンパ腫におけるゲノム異常の探索
網羅的発現解析により、HBZ-Tg由来T細胞ではシトシン脱アミノ化酵素Activation-induced cytidine deaminase (AID)をコードする遺伝子Aicdaの発現が亢進していることを見出した。HBZはTGF-β/Smad経路を介してAicdaのプロモーターを活性化した。また、HBZ-Tgに発生したTリンパ腫由来の細胞株Ht48のエクソーム解析では、G-to-AおよびC-to-T変異が他の変異に比較し高頻度に認められ、AID発現亢進の関与が疑われる。
今回NDRG2の機能解析を行い、NDRG2をPTEN結合タンパク質として同定した。NDRG2はPP2A phosphataseをリクルートし、PTEN脱リン酸化状態に保ちPTENの有するphosphatase活性を活性化状態にする働きを同定した。ATLにおいてNDRG2は発現低下状態にあり、そのためPTENは恒常的にリン酸化状態を保ちPI3K/AKT情報伝達系が活性化状態となった。そのNDRG2低下の原因としてメチル化はHTLV-1Taxに依存しており、HTLV-1感染初期からのメチル化が示唆された。
2. HBZ-TGに発症するTリンパ腫におけるゲノム異常の探索
網羅的発現解析により、HBZ-Tg由来T細胞ではシトシン脱アミノ化酵素Activation-induced cytidine deaminase (AID)をコードする遺伝子Aicdaの発現が亢進していることを見出した。HBZはTGF-β/Smad経路を介してAicdaのプロモーターを活性化した。また、HBZ-Tgに発生したTリンパ腫由来の細胞株Ht48のエクソーム解析では、G-to-AおよびC-to-T変異が他の変異に比較し高頻度に認められ、AID発現亢進の関与が疑われる。
結論
本年度の解析からHBZはAidcaの転写を誘導することが明らかとなり、TGF-β/Smad経路の活性化に関連していることが示唆された。AIDは様々な悪性腫瘍にて発現上昇することが報告されており、G-to-A変異、C-to-T変異導入の原因となることが知られている。これらの所見はHBZ自身が遺伝子変異を誘導する機能を有していることを示唆しており、多段階発がん機構の一つである可能性がある。今後、HBZ-Tgから得られたゲノム情報とATL患者の情報を比較することにより、発がんにより重要なゲノム異常の特定が期待できる。ATLで見つかった白血病発症関連因子群の異常からウイルス感染防御破綻、ATL発症への道筋がわかってきた。
公開日・更新日
公開日
2015-09-02
更新日
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