難治性小児がんに対する組織的・包括的取り組みに基づく臨床的特性に関する分子情報の体系的解析と、その知見を活用した診断・治療法の開発

文献情報

• 文献番号: 201313008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 難治性小児がんに対する組織的・包括的取り組みに基づく臨床的特性に関する分子情報の体系的解析と、その知見を活用した診断・治療法の開発
• 課題番号: H22-３次がん-一般-011
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 清河 信敬(独立行政法人 国立成育医療研究センター 研究所 小児血液・腫瘍研究部)

研究分担者(所属機関)

• 中澤温子（中川温子）(独立行政法人　国立成育医療研究センター　病理診断部)
• 森　　鉄也　(独立行政法人　国立成育医療研究センター　小児がんセンター)
• 大喜多　　肇　(独立行政法人　国立成育医療研究センター　研究所　小児血液・腫瘍研究部 )
• 林　　泰秀　(群馬県立小児医療センター)
• 鶴澤　　正仁(愛知医科大学　医学部)
• 小川　　誠司　(京都大学　医学部)
• 大平　　美紀　(千葉県がんセンター　研究所　がんゲノム研究室)
• 福島　敬(筑波大学　医学医療系)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 13,924,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

難治性小児がんの急速な進展や再発を繰り返す予後不良な亜型について、網羅的-体系的な分子プロファイリングを行ない、その特性の新たな側面を明らかにし、得られた知見を有効な予後予測法や治療層別化法として臨床応用することを目標とした。これまでに網羅されていなかった稀少疾患や、臨床的に必要性が高い白血病の難治例などの疾患を優先的に解析した。

研究方法

臨床検体に対してマイクロアレイ、次世代シーケンサー等による網羅的な発現遺伝子、ゲノム構造、エピゲノム解析を行った。得られた分子情報に基づいてゲノム解析、定量PCR、フローサイトメトリー等による治療層別化法の開発や実用化を検討した。関連する倫理指針、法規を遵守し適切な倫理手続きを行ない実施した。

結果と考察

1)MRDは白血病の予後予測に有用である。免疫受容体遺伝子再構成を利用した定量PCRによる検出法はすでに層別化因子として臨床研究に導入されており、今年度は新たに初発ALL75例を解析して疾患別再構成検出率はBCP 95％、T 79％で、定量感度は0.01%以上であった。平行して、10カラーフローサイトメトリー法によりBCP-ALL 161例、T-ALL 33例に対するMRD解析を行い、9割以上の症例で検出感度0.01%以上のモニタリングが可能であった。また、ALL 119例中21例（17.6％）で特定のキメラ遺伝子を検出し、定量PCRによるMRD追跡を実施した。３者は異なる利点を持ったMRD検出法であり、併用によって更に有用な治療層別化法確立が可能と考えられ、相互の相関性について検討を進めている。2)近年欧米においてBCP-ALLの中でBCR-ABL1陰性だが陽性ALLに類似した遺伝子発現や臨床特性を示す症例群が予後不良亜群“Ph-like ALL”として注目されているが、診断基準は統一されていない。そこで、国内のBCP-ALL 235例に対して3つの異なる方法で診断し、結果を比較した。合わせてのべ23例（BCP-ALLの9.8%）がPh-likeと判定され、4年無病生存率66.7%～41.7%（BCP-ALL全体では83.2%）と予後不良な集団を抽出可能であったが、重複して診断された症例は約30-60%、３者に共通の症例は5例のみで、初発時の年齢や白血球数、IKZF1遺伝子の異常の頻度等、診断法により特徴が異なっていた。予後不良症例を層別化する方法として有用だが、診断基準の確立が急務で、さらに検討を進めている。3) 非Down症候群の急性巨核芽球性白血病43例でCBFA2T3-GLIS2を12例(27.9%)、NUP98-JARID1Aを４例(9.3%)、OTT-MALを10例(23.6%)で認め、前2者は予後不良、後者は予後良好であることが示唆された。AML19例で次世代シークエンサーによる全エクソン解析を行い、RAD21やSTAG2などのコーヒシン関連遺伝子やBCOR/BCORL1などの新規の原因遺伝子変異を同定した。4) 小児骨肉腫で治療感受性の異なる３つのグループに相関するゲノム異常プロファイルについて新規追加症例を用いて検証し、高い再現性を得た。次世代シーケンサーで409種の既知がん関連遺伝子の網羅的変異解析を行い、一部症例に新規変異を見いだした。5)神経芽腫の新規予後分類として提唱されたゲノム分類とINPC病理組織分類、組織像との間の相関性を明らかにした。組み合わせる事によって、より有用な予後分類法の確立が期待される。6) 小児の腎腫瘍でRASSF1Aのメチル化に着目し、腎横紋筋肉腫様腫瘍や腎明細胞肉腫ではその高メチル化が、間葉芽腎腫では低メチル化が特徴的パターンであること、THBS1のメチル化解析と併用することで3つの組織型が鑑別可能であることを示した。7) 散発性肺芽腫12例のゲノム解析により、11例でDICER1変異（うち10例がナンセンスもしくはフレームシフト変異とRNaseIIIbドメイン変異のbiallelic変異）、8例にTP53変異が検出され、前者が発症に重要な役割を果たしており、後者はセカンドヒットであることが示された。

結論

本研究の成果の一部は全国統一多施設共同臨床研究においてすでに治療層別化法として応用されており、Ph-like ALLに関する知見は、現在新たな治療戦略を確立する上での基礎情報としてプロトコール作成に活用されている。骨肉腫や腎肉腫などの分子プロファイリング情報に基づいた層別化や診断法は、臨床応用に向けてさらに研究を進めている。肺芽種やリンパ腫の分子プロファイリング情報は今後新たな標的因子探索や治療開発研究へ応用して行く。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201313008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 難治性小児がんに対する組織的・包括的取り組みに基づく臨床的特性に関する分子情報の体系的解析と、その知見を活用した診断・治療法の開発
• 課題番号: H22-３次がん-一般-011
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 清河 信敬(独立行政法人 国立成育医療研究センター 研究所 小児血液・腫瘍研究部)

研究分担者(所属機関)

• 中澤温子（中川温子）(独立行政法人　国立成育医療研究センター　病理診断部)
• 森　　鉄也(独立行政法人　国立成育医療研究センター　小児がんセンター)
• 大喜多　　肇(独立行政法人　国立成育医療研究センター　研究所　小児血液・腫瘍研究部)
• 林　　泰秀(群馬県立小児医療センター)
• 鶴澤　　正仁(愛知医科大学　医学部)
• 小川　　誠司(京都大学　医学部)
• 大平　　美紀(千葉県がんセンター　研究所　がんゲノム研究室)
• 福島　敬(筑波大学　医学医療系)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 第３次対がん総合戦略研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

難治性小児がんの網羅的-体系的な分子プロファイリングを行ない、予後予測法や治療層別化法として臨床応用することを目標とした。これまで網羅されていなかった稀少腫瘍や、臨床的に必要性が高い白血病の難治例などの疾患を優先し、急速な進展や再発を繰り返す予後不良な亜型を対象とした。

研究方法

マイクロアレイ、次世代シーケンサー等により、臨床検体に対して発現遺伝子、ゲノム構造、エピゲノムの網羅的解析を行った。得られた分子情報に基づいてシーケンス、定量PCR、フローサイトメトリー等による治療層別化法の開発や実用化を検討した。関連する倫理指針、法規を遵守し適切な倫理手続きを行ない実施した。

結果と考察

1) 分子MRD法の臨床応用を進め、全国規模の多施設共同治療プロトコールにおいて、すでに治療層別化法として導入された免疫受容体遺伝子再構成を利用した定量PCR法でのべ250例のリンパ性腫瘍の解析を行ない、平行して10カラーフローサイトメトリー法でのべ626例の解析を実施してその有用性を確認し、キメラ遺伝子PCR法とも合わせて共通症例に関する相関性の検討を進めた。今後、3つの方法を相補的に活用する事でより有用な治療層別化法の開発が期待される。2)T-ALLの予後不良亜群ETP-ALLと BCP-ALLの予後不良亜群Ph-like ALLの分子プロファイリングを行なって予後情報と相関解析を行ない、本法におけるその発症の実態を明らかにし、診断法の確立を行なった。本邦におけるETP-ALLの発症頻度はT-lineage ALLの20.5%と欧米よりもやや高く、γδ T-ALL、NK白血病、AML M0と類似した遺伝子発現様式を示すことが明らかとなった。ETP-ALLは、最高リスク群に分類される症例が多く、再発率、死亡率とも60.0%（T-ALL各 42.0%、33.3%）と予後不良であるが、現行の治療法も一定の効果を示していることから、今後、前方視的に解析を進めて、将来的な予後層別化法確立の中に組み込んで行く必要性が示唆された。Ph-like ALLはBCP-ALLの中でBCR-ABL1陰性だがPh1-ALLと類似した遺伝子プロファイルを示す症例群であり、診断法は確立されていない。本法においてもBCP-ALLの約1割がPh-likeに相当すると考えられるが、現在報告されている複数の診断法によってそれぞれ異なる予後不良の集団が抽出されることから、Ph-like ALLの概念は、BCP-ALLの新たな予後不良亜群の分類として有用であるものの、細胞遺伝学的背景が異なる様々な症例群を含んでいることが示唆され、今後その詳細を明らかにするとともに、診断基準や疾患概念の整理が必要と考えられる。しかし、この中に含まれるチロシンキナーゼ関連のキメラ遺伝子陽性症例についてはTKIが有効であるため別途治療層別化の対象として検討を進める必要性が示唆される。以上の成果は、現在進められている新たな治療プロトコール作成の基本情報として活用されている。3)AMLの様々な遺伝子異常を明らかにし、特にNUP98-NSD１キメラ遺伝子および類縁亜型は予後不良因子として新規治療プロトコールに導入される予定である。4)小児骨肉腫での治療感受性と相関するゲノム異常プロファイル、神経芽腫でのゲノム分類とINPC病理組織分類を組み合わせた新たなリスク分類、腎腫瘍での特定遺伝子（THBS1とRASSF1A）のメチル化に着目した鑑別診断法等を確立し、さらにその臨床応用を目指した検討を進めている。5) Ewing肉腫のIDH1、IDH2 変異、神経芽腫のALKの短縮型変異、横紋筋肉腫のゲノム変異、散発性肺芽腫のbiallelicなDICER1変異、Burkittリンパ腫でのZNF384の特異的発現等を明らかにし、モデル系での機能解析を実施した。診断や治療の分指標的としての意義について、さらに検討を進めている。

結論

分子MRD法やAMLの遺伝子異常に関する知見は、全国統一多施設共同臨床研究においてすでに治療層別化法として応用、検証されている。ETP-ALLやPh-like ALLに関する分子プロファイリング情報は、現在新たな治療戦略を確立する上での基礎情報としてプロトコール作成に活用されている。骨肉腫や腎肉腫、神経芽腫などの分子プロファイリング情報に基づいた層別化や診断法は臨床応用に向けてさらに研究を進めている。横紋筋肉腫、肺芽種、リンパ腫等の分子プロファイリングは、今後新たな標的因子探索や治療開発研究への発展が期待される。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-02
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201313008C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 難治性小児がんについて、治療抵抗性の急性リンパ芽急性白血病として近年着目されているETP-ALLやPh-like ALLのわが国における発症の実態とその分子特性を始めて体系的に明らかにした他、骨肉腫の治療反応性に応じたゲノムプロファイル、腎腫瘍の病型ごとのエピゲノムプロファイル、神経芽腫ゲノムおよび病理組織所見に基づくリスク分類の関連性等を明らかにし、急性骨髄性白血病、横紋筋肉腫、肺芽腫、悪性リンパ腫の新たな遺伝子異常を同定するなど、国内外から注目される学術的成果を挙げた。
• 臨床的観点からの成果: リンパ性腫瘍に対する微少残存病変（MRD)検出は、予後予測法としてすでに国内の全国規模の統一治療研究に導入されており、さらに簡便且つ有用な検出法を平行して検討してその臨床応用を目指している。治療抵抗性白血病の分子プロファイリングの成果は、国内の全国規模の統一治療研究の中で、次期治療研究における治療層別化の具体的なプロトコール作成の基礎資料として活用されている。骨肉腫、腎腫瘍、神経芽腫等の鑑別法やリスク分類法は臨床応用に向けて治療プロトコールへの導入に向けた検討が進められている。
• ガイドライン等の開発: 審議会等での参考、ガイドライン等の開発については特に成果はなかった。
• その他行政的観点からの成果: 審議会等での参考、行政施策への反映等の成果はなかった。
• その他のインパクト: マスコミ掲載、公開シンポジウムの開催等の成果はなかった。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 44件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 223件
• 学会発表(国際学会等): 42件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Iijima K, Yamada H, Miharu M, et al. ; ZNF385B is characteristically expressed in germinal center B cells and involved in B-cell apoptosis. ; Eur J Immunol. , 42 (12) , 3405-3415 (2012); 10.1002/eji.201242530.
• 原著論文2: Sato B, Katagiri YU, Iijima K, et al. ; The human CD10 lacking an N-glycan at Asn(628) is deficient in surface expression and neutral endopeptidase activity.; Biochim Biophys Acta. , 1820 (11) , 1715-1723 (2012); 10.1016/j.bbagen.2012.06.017.
• 原著論文3: Yamada H, Iijima K, Tomita O, et al. ; Effects of insulin-like growth factor-1 on B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.; Int J Hematol. , 97 (1) , 73-82 (2013); 10.1007/s12185-012-1234-3.
• 原著論文4: Kobayashi K, Mitsui K, Ichikawa H, et al. ; ATF7IP as a novel PDGFRB fusion partner in acute lymphoblastic leukemia in children.; Br J Haematol. , in press (2014); 10.1111/bjh.12834.
• 原著論文5: Kiyokawa N, Iijima K, Tomita O, et al. ; Significance of CD66c expression in childhood acute lymphoblastic leukemia.; Leuk Res. , 38 (1) , 42-48 (2014); 10.1016/j.leukres.2013.10.008.
• 原著論文6: Masuzawa A, Kiyotani C, Osumi T, et al.; Poor responses to tyrosine kinase inhibitors in a child with precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia with SNX2-ABL1 chimeric transcript.; Eur J Haematol. , 92 (3) , 263-267 (2014); 10.1111/ejh.12234.
• 原著論文7: Tomita O, Iijima K, Ishibashi T, et al.; Sensitivity of SNX2-ABL1 toward tyrosine kinase inhibitors distinct from that of BCR-ABL1.; Leuk Res. , 38 (3) , 361-370 (2014); 10.1016/j.leukres.2013.11.017.
• 原著論文8: Ueno H, Okita H, Akimoto S, et al.; DNA methylation profile distinguishes clear cell sarcoma of the kidney from other pediatric renal tumors.; PLoS One. , 8 (4) , e62233.- (2013); 10.1371/journal.pone.0062233.
• 原著論文9: Onda K, Iijima K, Katagiri YU, et al.; Differential effects of BAFF on B cell precursor acute lymphoblastic leukemia and Burkitt lymphoma.; Int J Hematol. , 91 (5) , 808-819 (2010); 10.1007/s12185-010-0567-z.
• 原著論文10: Kaneko T, Okita H, Nakajima H, et al.; Neuroblastoma cells can be classified according to distinctive glycosphingolipid expression profiles identified by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.; Int J Oncol. , 37 (5) , 1279-1288 (2010)
• 原著論文11: Asada K, Watanabe N, Nakamura Y, et al.; Stronger prognostic power of the CpG island methylator phenotype than methylation of individual genes in neuroblastomas.; Jpn J Clin Oncol. , 43 (6) , 641-645 (2013); 10.1093/jjco/hyt058.
• 原著論文12: Isogai E, Ohira M, Ozaki T, et al.; Oncogenic LMO3 collaborates with HEN2 to enhance neuroblastoma cell growth through transactivation of Mash1.; PLOS One. , 6 (5) , e19297- (2011); 10.1371/journal.pone.0019297.
• 原著論文13: Akter J, Takatori A, Hossain MS, et al.; Expression of NLRR3 orphan receptor gene is negatively regulated by MYCN and Miz-1, and its downregulation is associated with unfavorable outcome in neuroblastoma.; Clin Cancer Res. , 17 (21) , 6681-6692 (2011); 10.1158/1078-0432.CCR-11-0313.
• 原著論文14: Takagi D, Tatsumi Y, Yokochi T, et al.; Novel adaptor protein Shf interacts with ALK receptor and negatively regulates its downstream signals in neuroblastoma.; Cancer Sci. , 104 (5) , 563-572 (2013); 10.1111/cas.12115.
• 原著論文15: Gocho Y, Kiyokawa N, Ichikawa H, et al.; A novel recurrent EP300-ZNF384 gene fusion in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.; Leukemia. , 29 (12) , 2445-2448 (2015); 10.1038/leu.2015.111.
• 原著論文16: Ishibashi T, Yaguchi A, Kiyokawa N, et al.; Ph-like ALL-related novel fusion kinase ATF7IP-PDGFRB exhibits high sensitivity to tyrosine kinase inhibitors in murine cells.; Exp Hematol. , 44 (3) , 177-188 (2015); 10.1016/j.exphem.2015.11.009.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-04-28
• 更新日: 2016-06-20

収支報告書

• 文献番号: 201313008Z