肝臓に対する新規ＤＤＳを活用した経口遺伝子治療法の開発

文献情報

文献番号
201308002A
報告書区分
総括
研究課題名
肝臓に対する新規ＤＤＳを活用した経口遺伝子治療法の開発
課題番号
H23-医療機器-一般-002
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
横田　隆徳(東京医科歯科大学　大学院医歯学総合研究科)
研究分担者(所属機関)
  • 片岡　一則(東京大学大学院　マテリアル工学専攻)
  • 村上　正裕(大阪大谷大学　薬学部薬剤学)
  • 和田　猛(東京理科大学 薬学部生命創薬科学科)
  • 小比賀　聡(大阪大学　薬学研究科生物有機化学　核酸化学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究費
27,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
臨床応用を念頭に、合成機能性核酸分子の安定性及び有効性の向上、脂質分散製剤の送達効率及びその変動を改善するための核酸化学的検討、マウス及び最終目的としての霊長類動物実験を行なう。
研究方法
1)VE-PEG-CCPのエンドソーム脱出能評価
マウス血清から超遠心法を用いてHDLを抽出した。このHDLにCharge Conversional Polymer (CCP)にPEGを介してビタミンE (VE)を結合させたVE-PEG-CCPとVE結合二本鎖アンチセンス核酸(heteroduplex oligonucleotide: HDO)を結合させることで、核酸送達リポ蛋白複合体を調製した。得られた核酸送達リポ蛋白複合体をマウスに静脈投与し、3日後の肝臓における標的遺伝子発現量を定量した。
2)腸管内を模した評価系における酵素耐性能の評価
腸管内を模した培養液に各種核酸を添加し、一定時間で酵素反応を停止したものをサンプルとした。各サンプルを15%ポリアクリルアミドで電気泳動後、核酸染色し、分解性の評価を行った。
3) A型二重らせん構造を有する二本鎖核酸に選択的に結合するカチオン性人工オリゴ糖による二本鎖核酸の酵素耐性能の評価
A型二重らせん構造を有する二本鎖核酸のリン酸ジエステル部位の負電荷と効果的に相互作用可能な正電荷を有するオリゴジアミノ糖として新たに合成されたオリゴ2,6-ジアミノ-2,6-ジデオキシ-β-D-ガラクトース(ODGal)を結合させた二本鎖核酸の酵素耐性能を評価した。
4)霊長類におけるVE-siRNA-混合ミセル混合物の遺伝子治療効果の評価
　霊長類を用いた実験は、医薬基盤研霊長類医科学研究センターにおいて、VE-siRNA/CMによるカニクイザル及びマーモセットを用いた遺伝子治療実験計画（承認番号；DS22-11）に基づいて行った。実験前日の午後から絶食し、翌朝投薬3時間前にミルク（20g/30ml、約100kcal）を胃内投与した。各サルを麻酔下にVE-siRNA添加脂質分散製剤とした被検液3mlを直腸内投与した。投与直前および翌日に採血し、生化学検査を行って有効性及び副作用の評価を行った。
結果と考察
VE-PEG-CCP、VE-HDOとHDLからなる会合体を投与した群で標的遺伝子発現量の低下が確認された。このことから、VE-PEG-CCPの存在によりVE-HDOのエンドソーム脱出が促進され、効率的にHDOを細胞質へ送達可能なことが示唆された。
化学合成した各種cRNAのマウス結腸粘膜ホモジネート中での安定性を調べた結果、コントロールとして用いた天然型RNAが5分以内に分解されるのに対し、化学修飾核酸については、その化学修飾の種類や程度に応じて分解耐性特性が異なっていた。特に安定化効果が得られたのは、配列中央部のピリミジン残基を2’-OMe体に変換した場合であった。また、RNA二重鎖と４量体のODGal（1当量）の複合体形成により、RNAの分解を抑制した。これらの結果は核酸に消化管内の各種核酸分解酵素に対する耐性を持たせることを可能とした。
最後に、霊長類におけるVE-siRNA-混合ミセル混合物の遺伝子治療効果の評価について、カニクイザルに対してAPOBを標的にしたVE -siRNAを、リノール酸（10mM）を吸収促進剤とするナノ脂質分散製剤を一日おきに合計二回、30mg/head/回で注腸投与を行った。核酸製剤投与前後に採取した血液サンプルの免疫学的及び生化学的検査から、VE-siRNA注腸剤投与による肝機能障害等の顕著な副作用は検出されなかった。これに対して、投与後の血清中のトリグリセリド(TG)及びLDLコレステロール(LDLC)の有意な減少、及びHDLコレステロール(HDLC)の有意な上昇が観察された。これらの効果は、投与したVE-siRNAによる肝臓でのAPOB遺伝子発現の抑制効果に基づくものと考えられた。
結論
生体内遺伝子発現抑制評価において、VE-PEG-CCPの導入は標的遺伝子発現抑制効果の増強に貢献した。
化学修飾を適切に施す事により、核酸が腸管内環境下においても十分な安定性を持つ可能性が見いだされた。
A型二重らせん構造を有する二本鎖核酸に選択的に結合し、その熱力学的安定性を向上させ、ヌクレアーゼによる分解を阻害するカチオン性人工オリゴ糖として、ガラクトース誘導体が最も優れた性質を有することが示された。
VE-siRNAの脂質ナノ分散製剤が、霊長類においても、肝臓を標的とする経腸デリバリーシステムとして有効であることが示された。
　以上から、最終目標である経口核酸医薬の実現に向けた様々な障害の多くを本研究で解決することに成功した。今後更なる最適化を行うことで、臨床応用に向けた進展が大いに期待される。

公開日・更新日

公開日
2015-03-03
更新日
-

研究報告書（PDF）

文献情報

文献番号
201308002B
報告書区分
総合
研究課題名
肝臓に対する新規ＤＤＳを活用した経口遺伝子治療法の開発
課題番号
H23-医療機器-一般-002
研究年度
平成25(2013)年度
研究代表者(所属機関)
横田　隆徳(東京医科歯科大学　大学院医歯学総合研究科)
研究分担者(所属機関)
  • 片岡　一則(東京大学大学院　マテリアル工学専攻)
  • 村上　正裕(大阪大谷大学　薬学部薬剤学)
  • 和田　猛(東京理科大学　薬学部・生命創薬科学科)
  • 小比賀　聡(大阪大学　薬学研究科生物有機化学　核酸化学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 医療機器開発推進研究
研究開始年度
平成23(2011)年度
研究終了予定年度
平成25(2013)年度
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
化学合成したsmall interfering RNA (siRNA)等の機能核酸は、遺伝子治療を目的としたin vivoへの応用において、注射製剤以外の投与方法がなく、長期間投与が可能な経口投与法を確立する必要がある。我々は天然型VEであるα-tocopherol (Toc)をベクターとして直接siRNAに結合させたToc-siRNAを直腸内投与することで、注腸投与による遺伝子治療法の可能性を検討した。
研究方法
1) マウスへの核酸注腸投与実験
マウスを16時間絶食にし、300 µlのミルクを30分おきに3回強制経口投与し、最終投与の30分後に麻酔をかけた。小腸または大腸にシリコンチューブを挿入し、生理食塩水で腸管を洗い、腸管の遠位側または肛門を結紮することで約5 cmの腸管ループを作った。そして小腸ループの近位側または肛門から、下記の条件で1回の投与につき10 mg/kgのToc-siRNAを投与した。2時間おきに3回投与し、最終投与の2、24時間後に採血をし、冷却したPBSで灌流した後に各臓器を採取した。Toc-siRNAの標的遺伝子としてアポリポ蛋白B (ApoB)を選んだ。
2) 霊長類におけるToc-siRNA-混合ミセル混合物の遺伝子治療効果の評価
2.4kg～2.9kgのカニクイザルを用いた。実験の前日の午後に絶食を施し、翌朝、投薬3時間前にミルク（20g/30ml、約100kcal）を胃内投与した。各サルを筋肉注射によるケタミン・キシラジン麻酔後、Toc-siRNAを30mg/kgの用量で、脂質分散製剤とした被検液3mlを直腸内投与し、投与後暫時保定した。投与は一日おきに二回繰り返し、各投与直前および最終投与翌日に採血し、生化学検査を行って肝機能・腎機能等の副作用の評価及び今回のToc-siRNAの標的遺伝子であるAPOBを抑制することで期待される低比重リポ蛋白(low-density lipoprotein: LDL)や中性脂肪(Triglyceride: TG)等の血清中各種脂質の測定を行った。
結果と考察
Toc-siRNAを2時間おきに10 mg/kgで3回注腸投与した際のin vivoでの標的遺伝子発現抑制効果を確認した。今回用いたToc-siRNAのターゲットであるApoBの肝臓における発現抑制を遺伝子レベルや血清中性脂肪、LDLコレステロールだけでなく、血清中のApoBタンパクレベルでも確認した。また、血液検査の結果免疫賦活性を含めた明らかな副作用は認められなかった。これらの結果から、ApoBを標的としたToc-siRNAの注腸投与は新たな高脂血症治療法となり得ると考えた。
次に、カニクイザルに対してAPOBを標的にしたToc-siRNAを注腸投与した。核酸製剤投与前後に採取した血液サンプルの免疫学的及び生化学的検査から、Toc-siRNA注腸剤投与による肝機能障害等の顕著な副作用は検出されなかった。これに対して、投与後の血清中のトリグリセリド(TG)及びLDLコレステロール(LDLC)の有意な低下、及びHDLコレステロール(HDLC)の有意な上昇が観察された。これらの効果は、投与したToc-siRNAによる肝臓でのAPOB遺伝子発現の抑制効果に基づくものと考えられた。
肝臓への経消化管siRNAデリバリーは、RNaseによるsiRNAの分解や水溶性巨大分子であるsiRNAの膜透過性の低さなどの障害から、今まで報告がなかったが、我々は経口摂取後のビタミンEの生理学的取り込み経路を利用することで、肝細胞への経消化管siRNAデリバリーに成功した。経消化管核酸医薬デリバリー法である本研究は経口腸溶剤や座薬に応用できるため、自己投与・長期間投与が可能となり、静脈注射で必須だった頻回の医療機関への受診等を避けられることから費用対効果も優れている。本研究は主にAPOBを標的とした核酸医薬を用いることで高脂血症治療の可能性を示したが、標的を変えることでウイルス性肝炎、肝臓がん、家族性アミロイドポリニューロパチー等の治療も可能になると考えられる。これらは長期に渡る治療が必要であり、経口投与は患者の生活の質の維持に大きく寄与する。
結論
経口摂取後のビタミンEの生理学的取り込み経路を利用することで、肝細胞への経消化管siRNAデリバリーに成功した。また、Toc-siRNAの脂質ナノ分散製剤が、霊長類においても肝臓を標的とする経腸デリバリーシステムとして有効であることが示された。
以上から、最終目標である経口核酸医薬の実現に向けた様々な障害の多くを本研究で解決し、その有効性を高めることに成功した。今後更なる最適化を行うことで、臨床応用に向けた進展が大いに期待される。

公開日・更新日

公開日
2015-03-03
更新日
-

研究報告書（PDF）

行政効果報告

文献番号
201308002C

成果

専門的・学術的観点からの成果
本研究では核酸医薬の経口投与を可能とする基盤技術の開発を目指し、新規DDSとして混合ミセルとともにビタミンE結合siRNAを注腸投与方法を最適化することによりリンパ管を経由して受容体介在性に肝臓に取り込まれることを確認した。その結果ビタミンE結合siRNA-混合ミセル混合物を霊長類であるカニクイザルに注腸投与して、肝臓の標的遺伝子発現抑制効果によると考えられる表現系の変化を確認し、本事業の最終目的を達成した。
臨床的観点からの成果
ビタミンE結合siRNA-混合ミセル混合物を霊長類であるカニクイザルに注腸投与して、肝臓の標的遺伝子発現抑制効果によると考えられる表現系の変化を確認し、本事業の最終目的を達成できたことは、核酸医薬の限定された対象疾患の大きなボトルネックであった、局所投与以外には経静脈的および皮下投与しかできなかったことにたいして、大きな進歩である。この成果によって患者が医療機関にもいかずに核酸医薬の在宅で治療が可能が出てきた。

ガイドライン等の開発
日本では核酸医薬の臨床応用はまったく実現しておらず、レギュレーション自体はない状況で、ガイドラインの前段階である。
その他行政的観点からの成果
核酸医薬は薬事のレギュレーション自体はない状況の中にあって、核酸医薬の臨床応用への行政的な確かなステップになったのではないかと思われる。
その他のインパクト
特になし。

発表件数

原著論文（和文）
0件
原著論文（英文等）
71件
その他論文(和文)
0件
その他論文(英文等)
0件
学会発表(国内学会)
106件
学会発表(国際学会等)
74件
その他成果(特許の出願)
8件
その他成果(特許の取得)
8件
取得６：キメラ二重鎖核酸.米国特許第9816089号.取得８：薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法.米国特許第9937263号
その他成果(施策への反映)
0件
その他成果(普及・啓発活動)
0件

特許

特許の名称
経大腸吸収用医薬組成物
詳細情報
分類:
特許番号: 米国：13/817,172　EP：11817940.7
発明者名: 横田隆徳, 村上正裕, 仁科一隆.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20110819
国内外の別: 米国出願
特許の名称
キメラ二重鎖核酸
詳細情報
分類:
特許番号: PCT/JP2012/083180
発明者名: 横田隆徳, 仁科一隆, 水澤英洋, 小比賀聡
権利者名: 東京医科歯科大学, 大阪大学
出願年月日: 20121217
国内外の別: 国際出願
特許の名称
二重鎖核酸結合剤、当該結合剤－二重鎖核酸複合体、当該複合体を含有する医薬品組成物、及び、当該複合体の製造方法.
詳細情報
分類:
特許番号: 2013-057521
発明者名: 横田隆徳, 仁科一隆, 和田猛, 前田雄介.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20130321
国内外の別: 国内出願
特許の名称
薬剤送達用のキャリア、コンジュゲートおよびこれらを含んでなる組成物並びにこれらの投与方法
詳細情報
分類:
特許番号: 特願2013-242347
発明者名: 横田隆徳, 桑原宏哉, 仁科一隆, 水澤英洋.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20131122
国内外の別: 国内出願
特許の名称
経大腸吸収用医薬組成物
詳細情報
分類:
特許番号: 特許第5892658号
発明者名: 横田隆徳, 村上正裕, 仁科一隆.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20110819
取得年月日: 20160304
国内外の別: 国内出願
特許の名称
Pharmaceutical Composition for transcolonic absorption
詳細情報
分類:
特許番号: 2015120100167250
発明者名: Takanori Yokota, Masahiro Murakami, Kazutaka Nishina
権利者名: National University corporation Tokyo Medical and Dental University
出願年月日: 20110819
取得年月日: 20151204
国内外の別: 国際出願（中国）
特許の名称
経大腸吸収用医薬組成物
詳細情報
分類:
特許番号: 米国特許第9,731,025号
発明者名: 横田隆徳, 村上正裕, 仁科一隆.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20110819
取得年月日: 20170815
国内外の別: 米国特許
特許の名称
二重鎖核酸結合剤、当該結合剤－二重鎖核酸複合体、当該複合体を含有する医薬品組成物、及び、当該複合体の製造方法.
詳細情報
分類:
特許番号: 特許第6300212号
発明者名: 横田隆徳, 仁科一隆, 和田猛, 前田雄介.
権利者名: 東京医科歯科大学
出願年月日: 20130321
取得年月日: 20180309
国内外の別: 国内特許

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限ります。

原著論文1
Iwata R, Nishina K, Yokota T, et al.
Synthesis and properties of double-stranded RNA-bindable oligodiaminogalactose derivatives conjugated with vitamin E.
Bioorg Med Chem , 22 , 1394-1404  (2014)
原著論文2
Pittella F, Cabral H, Maeda Y, et al.
Systemic siRNA delivery to a spontaneous pancreatic tumor model in transgenic mice by PEGylated calcium phosphate hybrid micelles.
J Control Release , 178 , 18-25  (2014)
原著論文3
Takemoto H, Miyata K, Hattori S, et al.
Acidic pH-responsive siRNA conjugate for reversible carrier stability and accelerated endosomal escape with reduced IFNα-associated immune response.
Angew Chem Int Ed , 52 , 6218-6222  (2013)
原著論文4
Maeda Y, Iwata R, Wada T.
Synthesis and properties of cationic oligopeptides with different side chain lengths that bind to RNA duplexes.
Bioorg Med Chem , 21 , 1717-1723  (2013)
原著論文5
Suma T, Miyata K, Ishii T, et al.
Enhanced stability and gene silencing ability of siRNA-loaded polyion complexes formulated from polyaspartamide derivatives with a repetitive array of amino groups in the side chain.
Biomaterials , 33 , 2770-2779  (2012)
原著論文6
Christie RJ, Miyata K, Matsumoto Y, et al.
Effect of polymer structure on micelles formed between siRNA and cationic block copolymer Comprising thiols and amidines.
Biomacromolecules , 12 , 3174-3185  (2011)
原著論文7
Pittella F, Zhang M, Lee Y, et al.
Enhanced endosomal escape of siRNA-incorporating hybrid nanoparticles from calcium phosphate and PEG-block charge-conversional polymer for efficient gene knockdown with negligible cytotoxicity.
Biomaterials , 32 , 3106-3114  (2011)
原著論文8
Murakami M, Nishina K, Watanabe C, et al.
Enteral siRNA delivery technique for therapeutic gene silencing in the liver via the lymphatic route
Scientific Reports , 5 , 17035-17047  (2015)

公開日・更新日

公開日
2015-05-26
更新日
2018-06-08

収支報告書

文献番号
201308002Z
報告年月日

収入

(1)補助金交付額
35,100,000円
(2)補助金確定額
35,100,000円
差引額 [(1)-(2)]
0円

支出

研究費 (内訳) 直接研究費 物品費 11,969,628円
人件費・謝金 11,192,039円
旅費 907,218円
その他 2,931,115円
間接経費 8,100,000円
合計 35,100,000円

備考

備考
-

公開日・更新日

公開日
2015-06-16
更新日
-